烏天麻不同溶劑提取物的總多酚、總黃酮含量及其抗氧化能力

天麻(Gastrodia elata Bl.)為蘭科(Orchidaceae)天麻屬多年生草本植物的干燥塊莖,已于2019年納入藥食同源管理試點,具有極高的藥用和食用價值[1]。中醫(yī)認為天麻能夠息風(fēng)止痙、平抑肝陽、祛風(fēng)通絡(luò)。現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)天麻具有抗氧化、抗炎、鎮(zhèn)痛、抗癲癇、改善心腦血管疾病、抗糖尿病和平喘等功效[2-3],這與其富含酚類、黃酮類、多糖類、甾醇類、有機酸、萜類、微量元素、揮發(fā)油等功效成分密切相關(guān)[4-5],其中天麻酚類及其苷類成分如天麻素、對羥基苯甲醇和巴利森苷類化合物等均是其主要藥理活性來源[6]。

烏天麻是天麻中的優(yōu)良品種[7-8],主要分布在云南、四川、貴州和重慶等地,近年來由于其重要的食用和藥用價值已經(jīng)引起國內(nèi)外學(xué)者廣泛關(guān)注。目前研究主要集中在不同產(chǎn)地天麻的化學(xué)成分[9-10]和功效[11]等方面,尤其是對天麻素的研究[12-13],也有關(guān)于其加工和貯藏的研究[14-15],但關(guān)于烏天麻的研究還很欠缺,制約了其產(chǎn)業(yè)發(fā)展。不同溶劑對植物提取物中活性物質(zhì)的含量和抗氧化活性有很大影響,目前天麻的常用提取溶劑有甲醇、稀乙醇和水等,但有關(guān)不同溶劑提取烏天麻的研究還鮮見報道。試驗以云陽烏天麻為原料,采用5種不同溶劑分別提取烏天麻,通過比較總多酚與總黃酮含量,并采用HPLC定性定量分析其主要的化學(xué)成分,評估不同溶劑提取物的抗氧化能力及與活性成分含量的相關(guān)性,以期為烏天麻的高效提取和利用及功能食品開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

干烏天麻(重慶云陽),重慶渝峰烏天麻集團有限公司。蘆丁、抗壞血酸(均為分析純),中國食品藥品檢定研究院；DPPH、NaNO2、NaOH、Na2CO3、沒食子酸,山東西亞化學(xué)股份有限公司；ABTS(分析純),美國Sigma公司；Al(NO3)3(分析純),成都市科龍化工試劑廠；甲醇(分析純),重慶川東化工有限公司；甲酸(色譜純),麥克林；乙腈(色譜級),美國Fisher公司。腺苷(批號：58-61-7)、天麻素(批號：62499-27-8)、對羥基苯甲醇(批號：623-05-2)、巴利森苷E(批號：952068-57-4)、對羥基苯甲醛(批號：123-08-0)、巴利森苷B(批號：174972-79-3)、巴利森苷C(批號：174972-80-6)、巴利森苷A(批號：62499-28-9),上海源葉生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

752型紫外可見光分光光度計,上海舜宇恒平科技儀器有限公司；KQ3200E型超聲波清洗器,昆山市超聲儀器有限公司；YF-118B型高速藥物粉碎機,浙江省瑞安市環(huán)球藥械廠；AUW220D型分析天平、Shimadzu 20A高效液相色譜儀,日本島津公司；TD-6M型低速離心機,四川蜀科儀器有限公司；T18Digital型高速分散機、RV10AUTO控制性旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀,IKA公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 烏天麻提取物制備

將干品烏天麻粉碎,準(zhǔn)確稱取烏天麻粉末2.0 g,置于100 mL離心管中,按照1∶25(g∶mL)料液比分別加入體積分數(shù)為70%丙酮、70%乙醇、70%乙腈、70%甲醇和水的溶劑,12 000 r/min均質(zhì)2次,每次2 min,超聲波(550 W,40 kHz)提取60 min,25 ℃冷卻,補足減少的質(zhì)量,4 000 r/min離心20 min,取上清液,抽濾,將濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至近干,殘留物用10%乙腈溶解,定容至10 mL,即得提取物溶液,-18 ℃冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 總多酚和總黃酮含量測定

參考LI等[16]的方法進行,取200 μL樣液加入試管中,再依次加入800 μL去離子水、200 μL福林酚試劑,振搖混勻,避光保存6 min,再加入2 mL質(zhì)量分數(shù)7% Na2CO3溶液和1.6 mL去離子水,避光條件下放置90 min后于波長760 nm處測定吸光度值。配制質(zhì)量濃度為0、10、20、40、60、80、100、150、200 μg/mL的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液,以沒食子酸質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x),吸光度為縱坐標(biāo)(y),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得回歸方程為：y=0.004x+0.019(R2=0.997 0)。結(jié)果以每克烏天麻干品中所含沒食子酸當(dāng)量(mg GAE/g)表示。

參考熊雙麗等[17]的方法進行,取5 mL樣液加入試管中,加入0.3 mL質(zhì)量分數(shù)5%亞硝酸鈉,搖勻,靜置6 min,再加入0.3 mL質(zhì)量分數(shù)5%硝酸鋁,搖勻,靜置6 min,再加入4 mL質(zhì)量分數(shù)4% NaOH溶液、0.4 mL質(zhì)量分數(shù)30%乙醇水溶液,混勻,放置12 min后于波長510 nm處測定吸光度值。配制質(zhì)量濃度為0、10、20、30、40、50、60、70 μg/mL的蘆丁標(biāo)液,以蘆丁質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x),吸光度值為縱坐標(biāo)(y),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得回歸方程為：y=0.005x+0.012(R2=0.999 0)。結(jié)果以每克烏天麻干品中所含蘆丁當(dāng)量(mg RE/g)表示。

1.3.3 烏天麻不同溶劑提取物組成成分分析

參考田孟華等[18]的方法,將烏天麻不同溶劑提取物和酚類標(biāo)準(zhǔn)品的乙腈溶液過0.45 μm微孔濾膜,用于HPLC分析。色譜條件：采用shim-pack VP-ODS色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)；流動相為乙腈(A)-0.1%甲酸(B)；流速1.0 mL/min；柱溫35 ℃；進樣量10 μL；檢測波長270 nm。梯度洗脫程序：0～8 min,99%～98%B；8～15 min,98%～92%B；15～25 min,92%B；25～35 min,92%～85%B；35～45 min,85%B；45～50 min,85～80%B；50～60 min,80% B(均為體積分數(shù))。

1.3.4 烏天麻不同溶劑提取物的抗氧化活性測定

1.3.4.1 DPPH自由基清除能力測定

參考CHEUNG等[19]的方法,并適當(dāng)修改,將烏天麻提取物稀釋成0、5、10、20、30、40、50 μg/mL的樣液,分別吸取1 mL加入5 mL 0.1 mmol/L DPPH溶液,混勻,室溫條件下避光靜置50 min,4 000 r/min離心10 min,取上清液于517 nm處測定樣品的吸光度Ai,以乙醇溶液為空白,測定其吸光度Aj。以抗壞血酸(VC)為對照。根據(jù)公式(1)計算樣品對DPPH自由基的清除率。

DPPH自由基清除率

(1)

1.3.4.2 ABTS陽離子自由基清除能力測定

參考SOONG等[20]的方法測定,制備ABTS陽離子自由基工作液,使其在室溫條件下于734 nm處吸光度為(0.70±0.02)。分別取3 mL不同質(zhì)量濃度(0.0、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 μg/mL)烏天麻提取液和1 mL ABTS工作液于試管中,混勻后30 ℃水浴反應(yīng)6 min,于734 nm處測定樣品的吸光度Ai,以乙醇溶液為空白,測定其吸光度Aj。以抗壞血酸(0～0.6 μg/mL)為對照。根據(jù)公式(2)計算樣品對ABTS陽離子自由基的清除率。

ABTS陽離子自由基清除率

(2)

1.3.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

每個試驗做3次平行,結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示,采用SPSS 21軟件進行顯著性分析(Duncan法)和Pearson相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 烏天麻不同溶劑提取物中總多酚和總黃酮分析

由表1可知,烏天麻不同溶劑提取物中總多酚和總黃酮含量差異顯著(P<0.05),總多酚含量為3.506～4.006 mg GAE/g,其中70%(體積分數(shù))甲醇和水提取物中總多酚含量最高,顯著高于70%(體積分數(shù))乙腈、70%乙醇和70%丙酮(體積分數(shù))提取物(P<0.05),但70%甲醇和水提取物中總多酚含量差異不顯著,說明烏天麻中總多酚主要以強極性為主。與總多酚結(jié)果相似,70%甲醇提取物中總黃酮含量最高,為1.290 mg RE/g,顯著高于其余溶劑提取物(P<0.05),且其余4種溶劑提取物中總黃酮含量無顯著差異。結(jié)果表明,烏天麻70%甲醇提取物中總多酚和總黃酮含量最高,與山楂甲醇提取物中總多酚和總黃酮含量最高的研究報道相一致[21]。

表1 烏天麻不同溶劑提取物中總多酚和總黃酮含量

Table 1 Contents of total phenolics and flavonoids of different solvents extracts from G.elata Bl.f.glauca S.Chow

注：同一行不同字母表示差異顯著(P<0.05)(下同)

2.2 烏天麻不同溶劑提取物組成成分分析

利用HPLC分析烏天麻不同溶劑提取物的組成成分及含量,混合標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖如圖1-a所示,烏天麻不同溶劑提取物的色譜圖如圖1-b～圖1-f所示,鑒定出腺苷、天麻素、對羥基苯甲醇、巴利森苷E、對羥甲苯甲醛、巴利森苷B、巴利森苷C、巴利森苷A共8種主要成分,其分子結(jié)構(gòu)見圖2。以標(biāo)準(zhǔn)品峰面積對質(zhì)量濃度進行線性回歸,得到標(biāo)準(zhǔn)品的回歸方程和提取物中主要成分含量結(jié)果見表2。

a-標(biāo)準(zhǔn)品；b-70%丙酮提取物；c-70%乙醇提取物；d-70%乙腈提取物；e-70%甲醇提取物；f-水溶劑提取物

圖1 烏天麻不同溶劑提取物及標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC圖

Fig.1 HPLC chromatograms of standard mixtures and different solvents extracts from G.elata Bl.f.glauca S.Chow

注:1～8為圖2中各活性成分

圖2 烏天麻提取物中主要活性成分的分子結(jié)構(gòu)

Fig.2 Molecular structure of the main active components existed in extracts from G.elata Bl.f.glauca S.Chow

由表2可知,烏天麻提取物中8種主要成分的含量高低依次為：天麻素>巴利森苷A>巴利森苷E>巴利森苷C>巴利森苷B>腺苷>對羥基苯甲醇>對羥基苯甲醛,表明烏天麻中含有較高的天麻素和巴利森苷類化合物。有研究報道,這些化合物具有較強的生理活性和多種藥理作用[22-23]。對不同溶劑提取效果進行比較分析,可知烏天麻不同溶劑提取物的主要成分含量有顯著性差異(P<0.05),其中70%丙酮提取物腺苷含量最高(0.108 mg/g),70%乙醇提取物天麻素含量最高(5.860 mg/g),均顯著高于水提取物含量(P<0.05),但與其余溶劑無顯著差異(P>0.05),陳琛等[24]在研究天麻水提取活性成分時發(fā)現(xiàn)天麻素含量高于總酚含量,與本研究結(jié)果相似,可能與測定方法原理有關(guān)。烏天麻水提取物對羥基苯甲醇含量最高,為0.078 mg/g,70%甲醇提取物中巴利森苷E(4.181 mg/g)、對羥基苯甲醛(0.014 mg/g)、巴利森苷B(1.745 mg/g)和巴利森苷C(2.255 mg/g)含量顯著高于其余溶劑提取物(P<0.05),70%甲醇、70%乙腈和70%丙酮提取物中巴利森苷A含量高于70%乙醇(體積分數(shù))和水提取物,且有顯著性差異(P<0.05)。這與不同溶劑提取對牦牛酥油磷脂脂肪酸組成成分含量有影響的結(jié)果一致[25]。

表2 烏天麻不同溶劑提取物的活性成分含量 單位：mg/g

Table 2 Active components contents in different solvents extracts from G.elata Bl.f.glauca S.Chow

注：各標(biāo)準(zhǔn)曲線R2均>0.999 8

2.3 烏天麻不同溶劑提取物抗氧化活性分析

2.3.1 DPPH自由基清除作用

由圖3-a可知,質(zhì)量濃度為0～50 μg/mL時,烏天麻不同溶劑提取物清除DPPH自由基能力隨質(zhì)量濃度增大而增大,但清除能力均小于VC且相互之間有差異。由圖3-b可知,水和70%甲醇提取物清除DPPH自由基的IC50值最小,分別是28.364和30.929 μg/mL,其次是70%乙腈、70%乙醇和70%丙酮提取物,IC50值分別為34.671、35.657、36.036 μg/mL,但均大于VC的IC50值23.345 μg/mL,所以水提取物清除DPPH自由基能力最好,70%丙酮提取物清除能力最弱。IC50值顯著性分析表明,除70%乙醇和70%丙酮提取物外,其余溶劑提取物清除DPPH自由基能力之間差異顯著(P<0.05),呈現(xiàn)出隨溶劑極性增大,提取物清除DPPH自由基能力增強的趨勢,可能與提取物中活性成分不同或含有多糖成分有關(guān)[26]。

a-DPPH自由基清除能力；b-IC50

圖3 不同溶劑提取物DPPH自由基清除能力及其IC50對比

Fig.3 DPPH free radical scavenging abilities and their IC50 values of extracts using different solvent

注：圖中不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)(下同)

2.3.2 ABTS陽離子自由基清除作用

由圖4-a可以看出,質(zhì)量濃度為0～0.5 μg/mL時,烏天麻不同溶劑提取物清除ABTS陽離子自由基能力均強于VC,且隨著質(zhì)量濃度增加,提取物清除ABTS陽離子自由基能力增強,當(dāng)達到0.3 μg/mL時,清除率均>87%,此后,清除ABTS陽離子自由基能力隨濃度增加的遞增趨勢逐漸變緩。由圖4-b可知,不同溶劑提取物清除ABTS陽離子自由基的IC50值大小順序為：維生素C>水>70%丙酮>70%乙醇>70%乙腈>70%甲醇,表明70%甲醇提取物清除ABTS陽離子自由基能力最好,IC50值為0.070 μg/mL,顯著高于水提取物IC50值0.099 μg/mL(P<0.05),但與其他3種溶劑提取物差異不顯著。與CUI等[27]報道的銀杏葉外果皮甲醇提取物抗氧化活性最強結(jié)果相似。

a-ABTS陽離子自由基清除能力；b-IC50

圖4 不同溶劑提取物ABTS陽離子自由基清除能力及其IC50對比

Fig.4 ABTS cationic radical scavenging abilities and their IC50 values of extracts using different solvent

由上述結(jié)果可知,烏天麻不同溶劑提取物清除DPPH自由基和ABTS陽離子自由基能力的結(jié)果不完全一致,可能與提取溶劑極性、活性成分結(jié)構(gòu)性質(zhì)及抗氧化體系不同有關(guān),總體來看,烏天麻不同溶劑提取物中70%甲醇提取物表現(xiàn)出較好的抗氧化活性。

2.4 烏天麻不同溶劑提取物中活性成分與抗氧化活性的相關(guān)性分析

烏天麻不同溶劑提取物的活性成分含量與抗氧化活性之間相關(guān)性分析結(jié)果如表3所示。烏天麻中總多酚含量與清除DPPH自由基能力呈顯著正相關(guān)(P<0.05),總黃酮含量與清除ABTS陽離子自由基能力呈極顯著正相關(guān)(P<0.01),與JAWHARI等[28]研究報道一致,即酚類和黃酮含量與抗氧化活性之間存在一定的相關(guān)性。烏天麻組成成分中腺苷、天麻素、對羥基苯甲醇、對羥基苯甲醛、巴利森苷E、巴利森苷C和巴利森苷A與抗氧化活性之間有一定相關(guān)性,其中對羥基苯甲醇含量與清除DPPH自由基能力達到顯著正相關(guān)(P<0.05),腺苷含量與清除DPPH自由基能力呈極顯著負相關(guān)(P<0.01),天麻素、巴利森苷A等成分含量與DPPH自由基清除能力呈負相關(guān),該結(jié)果與華東覆盆子鞣花酸、沒食子酸含量和DPPH自由基清除能力呈顯著負相關(guān)以及芒果葉酚類成分含量與生物活性呈負相關(guān)的研究結(jié)果相似[29-30]。對羥基苯甲醛和巴利森苷C含量與清除ABTS陽離子自由基能力存在顯著正相關(guān)關(guān)系(P<0.05),天麻素、巴利森苷E、巴利森苷B和巴利森苷A含量與清除ABTS陽離子自由基能力呈正相關(guān),這與GAO等[31]結(jié)果相似,其在研究不同產(chǎn)地來源的天麻中發(fā)現(xiàn)對羥基苯甲醇含量高的天麻樣品表現(xiàn)出較強的抗氧化活性。不同的是,研究發(fā)現(xiàn)幾種烏天麻組成成分含量與DPPH自由基清除率呈負相關(guān),造成這種組成成分含量與清除DPPH自由基能力不匹配的原因可能與水提取物8種組成成分含量最少而清除DPPH自由基能力卻最好有關(guān),PROVENZANO等[32]研究報道,一種苔蘚植物的水提取物較80%甲醇和80%乙醇提取物氧化自由基吸收能力(oxygen radical absorbance capacity,ORAC)值最高。結(jié)果表明,烏天麻提取物的抗氧化活性可能是多種活性成分之間相互作用的結(jié)果,既與總多酚和總黃酮含量相關(guān),又與組成成分種類和含量相關(guān)。

表3 烏天麻活性成分含量與抗氧化活性的相關(guān)性分析

Table 3 Correlation analysis between the contents of active components and antioxidant activities

注：*,顯著相關(guān)(P<0.05);**,極顯著相關(guān)(P<0.01)

過量的活性氧會觸發(fā)自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng),導(dǎo)致健康問題,如老化和細胞損傷[33]。富含抗氧化成分的天然膳食已被發(fā)現(xiàn)是解決這一問題的有效方法,因為其能夠中斷這些反應(yīng),清除自由基、協(xié)助細胞再生、預(yù)防癌癥和心血管疾病,從而提高健康水平。因此,發(fā)現(xiàn)和研究新的食用資源的抗氧化潛力具有重要意義。

3 結(jié)論

烏天麻不同溶劑[70%丙酮、70%乙醇、70%乙腈、70%甲醇(體積分數(shù))和水]提取物的活性成分含量及抗氧化活性之間差異顯著。烏天麻提取物的總多酚和總黃酮含量分別為3.506～4.006 mg GAE/g和1.100～1.290 mg RE/g,且70%甲醇提取物總多酚和總黃酮含量均最高；通過HPLC法對烏天麻提取物中組成成分進行分析,鑒定出8種主要成分,分別為腺苷、天麻素、對羥基苯甲醇、巴利森苷E、對羥基苯甲醛、巴利森苷B、巴利森苷C、巴利森苷A,其中70%乙醇提取物中天麻素含量最高,70%甲醇提取物中巴利森苷E、對羥基苯甲醛、巴利森苷B和巴利森苷C含量最高,并與其余溶劑提取物有顯著性差異。對不同溶劑提取物的抗氧化活性進行評價,可知水提取物清除DPPH自由基能力最強,其次是70%甲醇提取物,而70%甲醇提取物清除ABTS陽離子自由基效果最好。相關(guān)性分析結(jié)果表明,烏天麻不同溶劑提取物的抗氧化活性與總多酚、總黃酮及其組成成分的含量之間存在較高的相關(guān)性,這表明烏天麻抗氧化活性是多種物質(zhì)之間的協(xié)同作用,還有待進一步探索。