美拉德反應(yīng)改良羅非魚加工副產(chǎn)物熬煮液風味

近年來水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)蓬勃發(fā)展,養(yǎng)殖魚類已成為全球食用魚類的主要來源,羅非魚是重要的世界性養(yǎng)殖魚類之一[1],我國是全球主要的凍羅非魚生產(chǎn)國[2],每年產(chǎn)生的加工副產(chǎn)物占原料魚總量40%～60%[3-4],其合理利用的問題日益突出。對副產(chǎn)物進行高值化利用,開發(fā)多元產(chǎn)品,是羅非魚產(chǎn)業(yè)的重要發(fā)展方向。

目前利用魚副產(chǎn)物制備風味型營養(yǎng)食品已成為國際研究熱點之一,水產(chǎn)調(diào)味料在保留一部分天然風味的同時富含蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)以及維生素,應(yīng)用前景廣闊。羅非魚加工副產(chǎn)物中的必需氨基酸占氨基酸總量的57.3%,組成模式符合FAO/WHO推薦的理想模式,是優(yōu)良的水產(chǎn)調(diào)味料加工來源[5-6]。但水產(chǎn)調(diào)味料往往面臨著風味較為單一的問題,制約著相關(guān)產(chǎn)品的發(fā)展。

美拉德(Maillard)反應(yīng)是一種羰氨縮合的非酶褐變反應(yīng),是改善或增強食品風味的重要途徑,主要是以還原糖類為主的羰基化合物和以氨基酸和蛋白質(zhì)為主要類型的氨基化合物之間的復雜反應(yīng)[7],一系列反應(yīng)會生成包括不揮發(fā)性的香味物質(zhì)前驅(qū)物,揮發(fā)性香味物質(zhì)以及類黑精褐色含氮色素等復雜產(chǎn)物,賦予產(chǎn)品獨特的風味和色澤[8-9]。馮婷婷等[10]采用木糖與雜色蛤蒸煮液混合進行美拉德反應(yīng),制備出一種天然海鮮調(diào)味料；王茵等[11]選用花蛤蒸煮液與木糖進行美拉德反應(yīng),得到的產(chǎn)物在色澤、香氣上要優(yōu)于使用葡萄糖、核糖。

本研究以羅非魚熬煮液為原料,以美拉德反應(yīng)的中間產(chǎn)物、褐變程度以及感官評分為指標,考察木糖添加量、反應(yīng)時間、反應(yīng)溫度以及初始pH值對美拉德反應(yīng)的影響,優(yōu)化了美拉德增香工藝,并評價產(chǎn)物的氨基酸成分、揮發(fā)性成分、感官評定指標,以期為羅非魚加工副產(chǎn)物高值化利用提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

羅非魚購自國聯(lián)水產(chǎn),去除腮、內(nèi)臟、尾、鰭及腹內(nèi)黑膜,洗凈取下魚片后于-18 ℃保存；紫蘇脫腥液(100%純度),浙江世紫生物科技有限公司；海天牌食用白醋,廣州市海珠區(qū)客村華潤萬家；香芹液,市售小香芹以質(zhì)量比1∶2與蒸餾水榨汁破碎,浸泡30 min,沸水浴浸提30 min,趁熱使用400目濾布過濾后稀釋成70%的溶液；木糖、Na2HPO4(均為食品級),河南明瑞食品添加劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

HH-S-3L恒溫數(shù)顯油浴鍋,江蘇科析儀器有限公司；UV2550紫外可見分光光度計、GCMS-Qp2010島津氣質(zhì)聯(lián)用儀,日本島津公司；SQ510C立式壓力蒸汽滅菌器,日本雅馬拓公司；BS 224S電子天平,德國賽多利斯公司；EYELA N-1000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀,日本東京理化器械株式會社；809 Titrando自動電位滴定儀,瑞士萬通公司；DVB-pDMS65 μm固相微萃取頭,美國Supelco公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 羅非魚熬煮液制備

將洗凈的羅非魚加工副產(chǎn)物切碎后于室溫下浸入復合脫腥液(紫蘇液質(zhì)量分數(shù)7%、香芹液70%、白醋5%,魚肉與脫腥液料液比為1∶3[12])中60 min。瀝干水分后勻漿,以料液比1∶7(g∶mL)與蒸餾水均勻混合后轉(zhuǎn)入滅菌鍋,根據(jù)前期實驗設(shè)定熬煮時間為96 min,熬煮溫度為118 ℃,熬煮結(jié)束后用200目濾布過濾,將得到的魚湯進行真空濃縮(真空度0.95 MPa,濃縮溫度65 ℃,轉(zhuǎn)速100 r/min),濃縮至原有體積的20%,得到羅非魚熬煮液。

1.3.2 美拉德反應(yīng)產(chǎn)物制備

吸取10 mL羅非魚熬煮液于消解管中,按比例加入木糖,調(diào)節(jié)初始pH值后密封,轉(zhuǎn)入油浴鍋中進行反應(yīng),反應(yīng)結(jié)束后立即冰浴,降至室溫后備用。

1.3.3 美拉德反應(yīng)條件優(yōu)化

考察木糖添加量(質(zhì)量分數(shù)1%、1.5%、2%、2.5%、3%),反應(yīng)時間(20、40、60、80、100 min),反應(yīng)溫度(110、115、120、125、130 ℃)以及初始pH值(6.0、6.5、7.0、7.5、8)對美拉德反應(yīng)的影響,每項實驗重復3次。

1.3.4 正交試驗優(yōu)化美拉德反應(yīng)條件

在單因素試驗的基礎(chǔ)上,以感官評分為考察指標,選擇木糖添加量、反應(yīng)時間、反應(yīng)溫度、初始pH值為影響因素,設(shè)計正交試驗,因素及水平如表1所示。

表1 正交因素水平表

Table 1 Orthogonal factor and level

1.3.5 低分子質(zhì)量香味中間體測定

美拉德反應(yīng)產(chǎn)物中的低分子質(zhì)量香味中間體可以用280 nm處紫外吸光度表示,吸光度越大,香味物質(zhì)越多[13]。將美拉德反應(yīng)產(chǎn)物抽濾后,稀釋100倍,以去離子水為參比,于280 nm處測定其吸光度。

1.3.6 褐變程度的測定

美拉德反應(yīng)的最后階段,所產(chǎn)生的類黑精物質(zhì)不斷增加,使產(chǎn)物顏色加深。將美拉德反應(yīng)產(chǎn)物稀釋10倍,以去離子水為參比,于420 nm處測定吸光度,作為褐變程度的指標。

1.3.7 感官評定

將美拉德反應(yīng)產(chǎn)物稀釋10倍,對待測樣品進行編號,由7名感官評定員(4男、3女)組成評價小組,根據(jù)表2中的感官評定標準對樣品進行打分,主要從海鮮味、色澤、外觀、甜味、腥味、焦苦味6個方向進行評分,每個評定方向5分,共30分,感官評分越高則表明可接受程度越高。

表2 感官評定標準

Table 2 Sensory evaluation standard

1.3.8 氨基酸分析

參照GB 5009.124—2016《食品中氨基酸的測定》測定16種氨基酸。

1.3.9 揮發(fā)性成分分析

分別稱取5 mL樣液于頂空瓶中,封口后于55 ℃平衡20 min,調(diào)整好位置插入萃取頭后在60 ℃下萃取30 min。

氣相色譜條件：進樣口溫度230 ℃,解析3 min；升溫條件：色譜柱初溫35 ℃,保持4 min,5 ℃/min 升至90 ℃保持4 min后,再以8 ℃/min 升至230 ℃保持5 min；載氣He,流量1.0 mL/L。質(zhì)譜條件：離子源(EI)溫度200 ℃；電子能量70 eV；掃描質(zhì)量范圍35～500 amu。

結(jié)果采用計算機NIST 11普庫數(shù)據(jù)庫進行檢索,選取匹配度>80(最大值為100)的化合物,按面積歸一化法進行分析,得到各揮發(fā)性成分相對含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 22.0 軟件對相關(guān)數(shù)據(jù)進行方差分析；采用Excel 2019 整理數(shù)據(jù)及繪制圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 木糖添加量的確定

美拉德反應(yīng)是羰基與氨基間反應(yīng),還原糖的添加量對美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的風味以及色澤起到重要影響。如圖1所示,隨著木糖添加量的增加,A280 nm與A420 nm也隨之增加,木糖添加量達到2%之后感官評分開始下降,結(jié)果表明還原糖的添加有益于美拉德反應(yīng)體系的進行,讓其生成了更多的低分子質(zhì)量香味中間體,但也直接導致了反應(yīng)最后階段積累了更多的類黑精物質(zhì),使褐變程度增大。過高添加量的木糖在加劇反應(yīng)程度的同時,自身也較難反應(yīng)完全,感官上具有較重的甜味以及輕微的焦苦味,色澤較重,因此綜合考慮,確定木糖的添加量為2%。

圖1 木糖添加量對美拉德反應(yīng)的影響

Fig.1 Effects of xylose addition on MRPs

2.2 反應(yīng)時間的確定

添加2%木糖作為美拉德反應(yīng)的還原糖,在美拉德反應(yīng)過程中,還原糖可產(chǎn)生具有甜味和焦糖味的低分子質(zhì)量香味中間體,但美拉德反應(yīng)時間的不同,低分子質(zhì)量香味中間體生成量也隨之變化。因此美拉德反應(yīng)的時間對產(chǎn)品的最終風味有著重要影響。由圖2可知,隨著反應(yīng)時間上升,A280 nm與A420 nm均不斷增加,表明美拉德反應(yīng)程度也在不斷增大,當反應(yīng)時間達到60 min,A280 nm幾乎不再增加,可能由于長時間反應(yīng),更多的中間產(chǎn)物轉(zhuǎn)化為了最終產(chǎn)物,反應(yīng)產(chǎn)物褐變程度不斷增大,色澤變深,出現(xiàn)明顯的焦苦味,風味變差,這也與感官評分結(jié)果相吻合。因此確定60 min為反應(yīng)時間。

圖2 反應(yīng)時間對美拉德反應(yīng)的影響

Fig.2 Effect of reaction time on MRPs

2.3 反應(yīng)溫度的確定

反應(yīng)溫度對美拉德反應(yīng)的影響極為明顯,溫度較低時,反應(yīng)難以完全進行,風味不會有太大改變,但溫度較高時,反應(yīng)速度會急劇加快,類黑精物質(zhì)快速累積,產(chǎn)生焦苦味,風味也被嚴重破壞[14]。如圖3所示,反應(yīng)溫度為120 ℃時,A280 nm和感官評分達到最高,但當溫度達到125 ℃,褐變程度急劇上升,A280 nm也開始下降,出現(xiàn)焦苦味,色澤呈褐色,嚴重影響感官評分,因此選擇120 ℃較為適宜。

圖3 反應(yīng)溫度對美拉德反應(yīng)的影響

Fig.3 Effect of reaction temperature on MRPs

2.4 初始pH值的確定

初始pH值對美拉德反應(yīng)體系的影響極為明顯,pH較低時,氨基的分離受到影響,風味不佳；pH過高時,美拉德反應(yīng)產(chǎn)物色澤較深,同時感官上產(chǎn)生焦苦味[15]。羅非魚熬煮液的pH值為(5.5±0.1),由圖4可知,隨著pH值的增加,熬煮液的褐變程度增大,pH 6.0～7.5時,低分子質(zhì)量的香味中間體增加,pH>7.5時,香味中間體減少,美拉德反應(yīng)的感官評分呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢,當pH>6.5時,隨著pH值增加,熬煮液出現(xiàn)焦糊味,并且色澤加深,使感官評分降低,初始pH值為6.5時,其感官整體接受度較高,評分最佳,表明pH值對美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的褐變程度影響較大。綜合考慮,初始pH值選為6.5比較合適。

圖4 初始pH值對美拉德反應(yīng)的影響

Fig.4 Effects of initial pH value on MRPs

2.5 正交試驗結(jié)果

在單因素試驗的基礎(chǔ)上,以感官評分為考察指標,選擇木糖添加量、反應(yīng)時間、反應(yīng)溫度、初始pH值為影響因素,設(shè)計正交試驗,試驗結(jié)果如表3所示。極差分析結(jié)果表明,各因素對美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的影響為：初始pH值>木糖添加量>反應(yīng)時間>反應(yīng)溫度；感官評分結(jié)果表明,美拉德反應(yīng)最佳工藝參數(shù)為A2B1C2D2,即木糖添加量2.0%,反應(yīng)時間60 min,反應(yīng)溫度120 ℃,初始pH值6.5。在此條件下進行驗證試驗感官評分為(25.6±0.33),所得美拉德反應(yīng)產(chǎn)物風味較好,具有濃郁的海鮮風味。

表3正交試驗設(shè)計及結(jié)果

Table 3 Orthogonal test design and result

2.6 美拉德反應(yīng)對氨基酸組成的影響

氨基酸對水產(chǎn)調(diào)味料的風味構(gòu)成起到極其重要的作用,按呈味特性可將氨基酸歸納為以下幾類：鮮味氨基酸(谷氨酸、天冬氨酸、丙氨酸、甘氨酸)、甜味氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸)、苦味氨基酸(纈氨酸、蛋氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸和組氨酸)[16-17]。由表4可知,反應(yīng)前后減少較為明顯的氨基酸有：酪氨酸(25.00%)、賴氨酸(35.48%)、精氨酸(26.67%),表明發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)的苦味氨基酸大于降解生成的,致使苦味氨基酸含量減少；鮮味、甜味的氨基酸含量均有所增加：天冬氨酸(5.26%)、絲氨酸(6.67%)、胱氨酸(4.67%)、脯氨酸(9.68%)、甘氨酸(6.84%)、丙氨酸(7.50%)含量增加,說明以上氨基酸均在反應(yīng)過程中對風味的形成起到了重要的作用。研究表明,甘氨酸與丙氨酸同木糖反應(yīng)可以產(chǎn)生醬香風味,使美拉德產(chǎn)物的風味得到進一步提升,此外,鮮味和甜味的氨基酸含量的增長也會為其帶來更高的層次性、醇厚度以及更佳的整體滋味[18]。實驗結(jié)果表明,美拉德反應(yīng)可以降低熬煮液中的苦味氨基酸,增加鮮味、甜味氨基酸,使熬煮液的感官評分增加,有效改善羅非魚熬煮液的風味,使其風味更佳整體和諧。

表4 美拉德反應(yīng)前后氨基酸組成的變化

Table 4 Changes of the amino acids component in the Maillard reaction products

注：表中+、-代表味道程度

2.7 美拉德反應(yīng)前后揮發(fā)性物質(zhì)的變化

采用GC-MS技術(shù)對羅非魚熬煮液以及美拉德反應(yīng)產(chǎn)物進行揮發(fā)性物質(zhì)分析,總離子流程圖如圖5、圖6所示。結(jié)果采用NIST 11普庫數(shù)據(jù)庫進行檢索,選取匹配度>80(最大值為100)的化合物,按面積歸一化法進行分析,得到各揮發(fā)性成分相對含量,詳見圖7及表5。美拉德反應(yīng)前后均檢出50種揮發(fā)性物質(zhì),前后數(shù)量雖未發(fā)生變化,但化合物種類及相對含量皆有較大的改變,使整體風味得到了一定的提升。

表5 揮發(fā)性成分分析

Table 5 Volatile components before and after Maillard reaction

圖5 羅非魚熬煮液揮發(fā)性成分總離子流程圖

Fig.5 GC-MS total ion chromatogram of tilapia-broth extraction

圖6 美拉德反應(yīng)產(chǎn)物揮發(fā)性成分總離子流程圖

Fig.6 GC-MS total ion chromatogram of MRPs

圖7 美拉德反應(yīng)前后揮發(fā)性物質(zhì)種類及個數(shù)變化

Fig.7 Chemical classes and number of volatile compounds before and after Maillard reaction

羰基化合物是熱加工過程中肉香成分的特征化合物,主要來源是脂類物質(zhì)的熱氧化降解以及氨基酸的降解[19-20],醛類物質(zhì)的閾值較低,對食品的風味構(gòu)成具有重要的貢獻,研究表明帶有6～10個碳的醛類物質(zhì)對肉香味的形成起到關(guān)鍵作用[21]。羅非魚熬煮液主要檢測到的醛類物質(zhì)有己醛(4.25%)、庚醛(0.33%)、壬醛(1.34%),反應(yīng)后相對含量大幅減少,3種物質(zhì)皆具有濃烈的脂肪香氣,稀釋后呈玫瑰及橙子的香味；另外,反應(yīng)后也生成了新的醛類物質(zhì)：2-甲基丁醛(6.95%),作為常用香料已廣泛用于食品工業(yè)中,具有可可香氣、水果香等風味,糠醛(1.04%)來源于糖類物質(zhì)的降解,具有烤肉的香味。醛類物質(zhì)的前后變化表明美拉德反應(yīng)使熬煮液的肉香風味更加柔和、圓潤,具有層次感。酮類物質(zhì)具有一定的堅果香、水果香,其閾值高于醛類物質(zhì),可以使食品整體風味得到增強,醛酮類物質(zhì)的交互作用在魚、肉制品形成獨特風味的過程中發(fā)揮了巨大的作用[22-23]。醇類物質(zhì)同樣來源于脂肪的氧化降解,閾值較高,除非以高濃度存在,否則對肉香味的形成貢獻很小,但仍具有相當?shù)膮f(xié)同作用[24],如反應(yīng)產(chǎn)物中檢測到的糠醇(6.08%),具有焦糖、醬香味,使特征風味進一步得到了增強。

氨基酸與還原糖在美拉德反應(yīng)作用下產(chǎn)生呋喃、吡嗪等雜環(huán)類化合物,閾值極低,具有濃郁的堅果、烤肉等令人愉快的風味。呋喃類化合物及其衍生物對肉香的形成有較大的貢獻,反應(yīng)前后其總相對含量由2.06%增長至5.53%；吡嗪類物質(zhì)是具有較強風味和氣味的一大類物質(zhì)[25],從羅非魚熬煮液中未檢出吡嗪類物質(zhì),而在美拉德反應(yīng)產(chǎn)物中檢出8種。羰-氨縮合具有pH依賴性,是吡嗪形成的先決條件,氨基在低pH體系中會質(zhì)子化,不能進行親核進攻,只有不帶電的氨基能夠與羰基縮合,因此酸性環(huán)境中羰-氨縮合速率較慢,難以生成吡嗪類物質(zhì)[26]。羅非魚熬煮液的pH值為(5.5±0.1),屬于偏酸性環(huán)境,經(jīng)工藝優(yōu)化后調(diào)整至pH 6.5,實驗結(jié)果與先前報道的相一致,表明反應(yīng)體系初始pH值對吡嗪類物質(zhì)的產(chǎn)生起決定性的作用。

此外,在羅非魚熬煮液中也檢測到了三甲胺(35.8 %),作為魚腥味的標志性物質(zhì)之一[27],反應(yīng)過后相對含量僅為2.17 %,說明美拉德反應(yīng)也具有一定的脫腥作用。酯類物質(zhì)的相對含量也有所減少,主要是由于在美拉德反應(yīng)的高溫下其發(fā)生水解作用,對香味有一定損失,但整體風味的提升可以有效彌補酯類物質(zhì)的損耗。其余所檢測到的烯烴、烷烴、芳香族等化合物,閾值較高,對整體風味影響不大。

3 結(jié)論

經(jīng)單因素試驗及正交試驗確定美拉德反應(yīng)改良羅非魚熬煮液風味的最佳工藝條件為：木糖添加量2.0%,反應(yīng)時間60 min,反應(yīng)溫度120 ℃,初始pH值6.5,在此條件下進行驗證試驗所得感官評分為(25.6±0.33)；氨基酸分析結(jié)果表明,美拉德反應(yīng)前后酪氨酸(25.00%)、賴氨酸(35.48%)、精氨酸(26.67%)等苦味氨基酸含量減少,天冬氨酸(5.26%)、絲氨酸(6.67%)、胱氨酸(4.67%)、脯氨酸(9.68%)、甘氨酸(6.84%)、丙氨酸(7.50%)等鮮味、甜味的氨基酸含量均有所增加,說明以上氨基酸均在反應(yīng)過程中對風味的形成起到了重要的作用。揮發(fā)性物質(zhì)分析表明,美拉德反應(yīng)前后風味物質(zhì)種類及數(shù)量均有所變化：醛類、醇類物質(zhì)總相對含量減少,酮類物質(zhì)有所增加,美拉德反應(yīng)使羰基化合物間協(xié)同作用增強,形成更佳和諧、整體的風味,呋喃類、吡嗪類等雜環(huán)類化合物相對含量升高,進一步強化了特征風味。以上結(jié)果表明,美拉德反應(yīng)大幅改善了羅非魚熬煮液原本單一的風味,在感官上帶來了濃郁的海鮮風味,此工藝具備開發(fā)天然水產(chǎn)調(diào)味料的相關(guān)條件,可為羅非魚加工業(yè)及調(diào)味品制造業(yè)提供一定的理論參考。