不同雄株銀杏葉提取液抗氧化能力及主要功能成分含量差異

銀杏葉提取物具有抗氧化、抗疲勞、降血脂、降血壓、增強免疫力、提高缺氧耐受力、抗腫瘤、改善老年人記憶力和心血管疾病等藥理作用[1],而抗氧化能力是體現(xiàn)其功能活性的一類重要指標。銀杏葉提取物可直接清除脂質(zhì)自由基、脂質(zhì)過氧化自由基和烷自由基等,終止自由基連鎖反應(yīng),同時還參與調(diào)節(jié)和提高過氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶等的活性。研究表明,許多黃酮類物質(zhì)的抗氧化活性超過維生素C,在體外可抗自由基攻擊[2]。植物體內(nèi)化學(xué)成分較多,且不同個體間差異較大。有研究表明,不同品種藍莓的提取液功能成分、抗氧化能力差異顯著[3]。此外,植物提取物同時包含多種功能成分,且各物質(zhì)間具有一定的互作效應(yīng)[4]。銀杏葉中成分復(fù)雜,主要生物活性成分有類黃酮、萜內(nèi)酯、多糖、原花青素等,其品質(zhì)無法用單一成分量化和直接反映。銀杏葉中的類黃酮、多糖、原花青素等均具有相當?shù)目寡趸钚?。DPPH自由基測定快速、簡便,氧自由基吸收能力法(oxygen radical absorbance capacity,ORAC)具有很高的特異性和良好的結(jié)果重現(xiàn)性,是目前國內(nèi)外評價天然產(chǎn)物抗氧化活性的2種主要方法,但這2種方法都不能全面、準確地反映天然產(chǎn)物的總抗氧化能力。目前,已有大量關(guān)于葉用銀杏優(yōu)良種質(zhì)選育的報道[5-10],但基于高抗氧化的葉用銀杏種質(zhì)的篩選還未見報道。本研究選用4種方法測評23個銀杏雄株葉提取液的抗氧化能力,同時測定提取液中功能性組分含量,分析兩者的株間差異和相關(guān)性,篩選出高抗氧化能力的雄株,為高抗氧化銀杏種質(zhì)資源的篩選提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試銀杏葉采自南京林業(yè)大學(xué)資源圃中移栽定植15年的23棵25年生銀杏雄株,于2020年4月1日采集樹冠外圍向陽葉片,裝于信封,烘箱內(nèi)105 ℃殺青15 min,調(diào)至60 ℃烘至恒重,粉碎過80目篩后備用。

1.2 儀器與試劑

Synergy2酶標儀,美國伯騰儀器有限公司；JP-100ST超聲波水浴鍋,潔盟清洗設(shè)備有限公司；JK-WB-8A水浴鍋,上海精學(xué)科學(xué)儀器有限公司；藥品均為分析純;水為超純水。

1.3 試驗方法

1.3.1 甲醇提取液制備

稱取葉干粉1.000 g,包于直徑12.5 cm的濾紙中,用脫脂棉線捆綁成柱狀濾紙包。先用100 mL石油醚于85 ℃水浴條件下在索氏提取器中對濾紙包除雜2.5 h,取出后于60 ℃烘箱中烘至恒重。再將除雜后的濾紙包用100 mL分析純甲醇于80 ℃水浴條件下索氏提取4.5 h。減壓濃縮后,殘渣用分析甲醇定容至25 mL,即得供試樣品提取液。每個樣品重復(fù)3次。

1.3.2 抗氧化能力測定

DPPH自由基清除率的測定參考姜愛麗等[3]的方法,吸取0.2 mL提取液與4 mL DPPH-乙醇溶液(0.04 mg/mL)于10 mL比色管,充分混勻,室溫避光靜置30 min后,于517 nm下測定吸光值A(chǔ)樣品。為扣除提取液底色的影響,以等量無水乙醇代替DPPH-乙醇溶液測定吸光值A(chǔ)對照,以等量無水乙醇代替提取液測定吸光值A(chǔ)空白,每個樣品重復(fù)3次。DPPH自由基清除率按公式(1)計算:

DPPH自由基清除率

(1)

·OH清除率的測定參考姚鑫[11]的方法,吸取1 mL FeSO4·7H2O(2.25 mmol/L)置于10 mL離心管,然后加入1 mL水楊酸溶液(2.25 mmol/L),再加入1 mL提取液,最后加入1 mL H2O2(2.2 mmol/L)啟動反應(yīng),混勻,37 ℃水浴30 min,在536 nm處測定吸光值A(chǔ)樣品。為扣除提取液底色的影響,以蒸餾水代替雙氧水測定吸光值A(chǔ)對照；以蒸餾水代替樣品提取液測定吸光值A(chǔ)空白,每個樣品重復(fù)3次?！H清除率按公式(2)計算:

·OH清除率

(2)

清除率的測定參考張曦元[12]的方法,吸取pH 8.2的磷酸緩沖液4.5 mL置于10 mL比色管中,然后加入1 mL提取液,25 ℃水浴30 min,再加入0.4 mL鄰苯三酚溶液(7 mmol/L)(25 ℃預(yù)溫),充分混勻,置于25 ℃水浴鍋反應(yīng)4 min,最后滴入2滴10 mol/L鹽酸終止反應(yīng)。以磷酸緩沖液調(diào)零,于320 nm處測定吸光值A(chǔ)樣品。為扣除底色影響,以蒸餾水代替樣品提取液測定吸光值A(chǔ)對照,以蒸餾水代替樣品溶液測定吸光值A(chǔ)空白,每個樣品重復(fù)3次。清除率按公式(3)計算:

清除率

(3)

總還原力的測定參考姚鑫[11]的方法,吸取0.3 mL提取液于10 mL試管中,然后加入3 mL FRAP工作液,充分混勻后,37 ℃水浴避光10 min,在593 nm處測定吸光值。以甲醇替代樣品作為空白,每個樣品重復(fù)3次。以FeSO4·7H2O為標準物,配成不同濃度的FeSO4·7H2O溶液,采用同樣的方法制作標準曲線(y吸光值=1.094 2x+0.072 7,r=999 8),計算總還原力。樣品測定的吸光值代入曲線方程,解得的x值即為樣品總還原力,即以達到同樣的抗氧化能力時,所需的FeSO4·7H2O物質(zhì)的量。

1.3.3 功能成分含量測定

總黃酮含量的測定參考符群等[4]的方法，吸取提取液1.0 mL和5 mL 30%乙醇(體積分數(shù)，下同)置于10 mL離心管中，然后加入0.3 mL 50 g/L的NaNO2溶液，搖勻靜置5 min，然后加入0.3 mL 100 g/L Al(NO3)3溶液，搖勻靜置6 min，再加入2 mL 1 mol/L 的NaOH溶液并用30%乙醇定容至刻度,搖勻靜置10 min,于510 nm處測吸光值。以30%乙醇溶液替代樣品作為空白,每樣品重復(fù)3次。以蘆丁為標準物,用甲醇配成不同濃度的蘆丁溶液,采用同樣的方法制作標準曲線(y吸光值=1.330 1x蘆丁+0.010 6,r=0.999 6),計算總黃酮含量。

萜內(nèi)酯含量的測定參考張渝陽等[13]的方法,吸取提取液1.0 mL置于10 mL離心管,加入0.4 mL堿性羥胺溶液[V(139 g/L氯化羥胺)∶V(3.5 mol/L NaOH)=1∶2],混勻,5 min后加入0.4 mL 3 mol/L 鹽酸,0.2 mL 60 g/L FeCl3·6H2O溶液,混勻,加入5 mL 70%乙醇,混勻,于517 nm處測吸光值,每個樣品重復(fù)3次。以銀杏內(nèi)酯A對照品為標準物,用甲醇配成不同濃度的銀杏內(nèi)酯A溶液,采用同樣的方法制作標準曲線(y吸光值=12.346x銀杏內(nèi)酯A+0.021,r=0.999 4),計算萜內(nèi)酯含量。

多糖含量的測定參考姜愛麗等[3]的方法,吸取1 mL稀釋20倍的提取液,置于10 mL離心管,加入1 mL 5% 苯酚溶液,搖勻,室溫靜置5 min,然后緩緩加入5 mL濃硫酸,搖勻,40 ℃水浴15 min,于490 nm處測定吸光值。每一樣品重復(fù)3次。以D-葡萄糖(純度≥99%)為標準物,配成0、0.05、0.1、0.15、0.2 mg/mL葡萄糖溶液,采用同樣的方法制作標準曲線(y吸光值=4.082 5xD-葡萄糖+0.041 7,r=0.999),計算多糖含量。

原花青素含量的測定參考喬洪翔等[14]的方法,吸取提取液1.0 mL置于10 mL離心管,加入5 mL顯色劑[將20 g/L香草醛溶液(無水乙醇溶解)和體積分數(shù)20%鹽酸(無水乙醇定容)等體積混勻],30 ℃下水浴8 min,于496 nm處測吸光值,每個樣品重復(fù)3次。以原花青素對照品為標準物,用80%乙醇配成不同濃度的原花青素溶液,采用同樣的方法制作標準曲線(y吸光值=0.294 1x原花青素+0.040 5,r=0.999 1),計算原花青素含量。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

采用Excel 2010進行數(shù)據(jù)整理,使用DPS7.04進行方差分析、Duncan多重比較、相關(guān)性分析和聚類分析。

2 結(jié)果分析

2.1 不同銀杏雄株葉提取液抗氧化能力比較

方差分析和多重比較顯示,銀杏雄株葉提取液清除DPPH自由基的能力及總還原力在單株間均存在極顯著差異(P<0.01),相應(yīng)抗氧化指標的變異系數(shù)分別為19.99%、34.18%、37.04%和13.50%(表1),表現(xiàn)出較高的變異性。最高單株的相應(yīng)抗氧化指標分別是最低單株的2.13、3.99、6.03、1.68倍。DPPH自由基清除率高于均值的單株有10個,由高到低依次為6#、2#、9#、4#、10#、12#、1#、11#、16#、13#；·OH清除率高于均值的單株有12個,由高到低依次為清除率高于均值的單株有11個,由高到低依次為6#、2#、9#、17#、12#、11#、16#、15#、22#、1#、3#；總還原力高于均值的單株有11個,由高到低依次為6#、10#、2#、16#、11#、4#、9#、15#、12#、1#、13#。

表1 銀杏葉提取液抗氧化能力的株間差異分析

Table 1 Antioxidant capacity of Ginkgo biloba extract among plants

注：同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)；不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)

2.2 不同銀杏雄株葉提取液功能性組分含量比較

由方差分析和多重比較可知,銀杏雄株葉提取液的總黃酮、萜內(nèi)酯、多糖、原花青素含量在單株間均存在極顯著差異(P<0.01),對應(yīng)功能性組分含量的變異系數(shù)分別為12.10%、9.30%、12.35%和15.63%,對應(yīng)功能成分指標最高單株分別是最低單株的1.74、1.46、1.57、1.78倍(表2),表現(xiàn)出一定的變異性?？傸S酮含量高于均值的單株有12個,由高到低依次為6#、16#、11#、2#、12#、9#、10#、21#、1#、3#、15#、5#；萜內(nèi)酯含量高于均值的單株有11個,由高到低依次為21#、3#、22#、11#、23#、20#、9#、10#、2#、16#、17#；多糖含量高于均值的單株有9個,由高到低依次為20#、9#、22#、11#、13#、21#、23#、17#、1#；原花青素含量高于均值的單株有12個,由高到低依次為19#、17#、2#、18#、1#、23#、11#、9#、20#、22#、12#、21#。

表2 銀杏葉提取液功能性組分含量的株間差異分析 單位：mg/g DW

Table 2 Functional components concentration in G.biloba extract

2.3 提取液抗氧化能力與功能性組分含量的相關(guān)分析

如表3所示,銀杏葉提取液中總黃酮含量與DPPH自由基清除率清除率、總還原力均呈極顯著中強度正相關(guān)(P<0.01)；萜內(nèi)酯含量與·OH清除率呈極顯著中強度負相關(guān)(P<0.01),與DPPH自由基清除率、總還原力呈弱度負相關(guān)；多糖含量與4個抗氧化指標呈中弱度負相關(guān),其中與·OH清除率的相關(guān)性達到顯著性水平(P<0.05)；原花青素含量與清除率呈弱度正相關(guān),而與DPPH自由基清除率、·OH清除率、總還原力呈中度或弱度的負相關(guān)。上述分析說明,總黃酮是銀杏葉甲醇提取液抗氧化作用的主要物質(zhì)基礎(chǔ)。

表3 功能性組分含量與抗氧化能力的相關(guān)性分析

Table 3 Correlation analysis between functional components content and antioxidant capacity

注：** 表示相關(guān)性極顯著(P<0.01),* 表示相關(guān)性顯著(P<0.05)

2.4 基于提取液抗氧化能力與功能性組分含量的聚類分析

基于標準化的提取液抗氧化能力與功能性組分含量,采用歐氏距離和類平均法(UPGMA)聚類,根據(jù)距離系數(shù)的大小,結(jié)合圖1的聚類特征,將23個銀杏雄性單株劃分為4個類群。其中第1類,僅有6#單株表現(xiàn)為總黃酮含量最高,萜內(nèi)酯、原花青素含量較低,多糖含量最低,DPPH自由基清除率清除率及總還原力最高,·OH清除率較高；第2類包含12個單株(1#、2#、3#、5#、9#、10#、11#、12#、15#、16#、17#、22#),表現(xiàn)為總黃酮、萜內(nèi)酯、多糖、原花青素含量較高,DPPH自由基清除率清除率、總還原力較高,而·OH清除率最低；第3類包含5個單株(18#、19#、20#、21#、23#),表現(xiàn)為總黃酮、萜內(nèi)酯、原花青素含量最低,多糖含量較低,DPPH自由基清除率清除率、總還原力較低、·OH清除率最高；第4類包含5個單株(4#、7#、8#、13#、14#),表現(xiàn)為總黃酮含量較低,萜內(nèi)酯、多糖和原花青素含量最高,DPPH自由基清除率清除率、總還原力最低,但·OH清除率較低(表4)。

圖1 基于提取液抗氧化能力與功能性組分含量的聚類分析

Fig.1 Cluster analysis based on antioxidant capacity and functional component content of extracts

表4 各類群的抗氧化能力與功能性組分含量

Table 4 Antioxidant capacity and functional component content of different groups

3 結(jié)論與討論

不同銀杏雄株葉中抗氧化功能成分含量和抗氧化活性差異顯著,具有豐富的遺傳多樣性,不同單株銀杏葉甲醇提取液的抗氧化能力與功能性組分含量的差異分析表明,提取液的抗氧化能力(DPPH自由基清除率及總還原力)及功能性組分(總黃酮、萜內(nèi)酯、多糖、原花青素)含量在單株間均呈極顯著差異(P<0.01),表現(xiàn)出較高的變異性,這種差異性除了受遺傳基因的控制外[5-10],還與栽培措施和生境等因素有關(guān)[15-21]。本研究的供試單株為地理環(huán)境和培育條件相同的同一資源圃里銀杏雄株,所以基因型是造成供試銀杏葉提取液抗氧化能力和功能組分含量差異的主要因素。這些廣泛的基因型差異為后續(xù)高抗氧化種質(zhì)篩選和育種奠定了基礎(chǔ)。

總黃酮含量與抗氧化能力顯著正相關(guān),總黃酮是銀杏葉甲醇提取液抗氧化作用的重要物質(zhì)基礎(chǔ),銀杏葉提取物具有較強的抗氧化活性[22-25]。本研究中甲醇能有效提取銀杏葉中的總黃酮和萜內(nèi)酯,其中總黃酮含量與抗氧化能力(DPPH自由基清除率清除率、總還原力)呈顯著正相關(guān),而萜內(nèi)酯含量與抗氧化能力相關(guān)性不強,甚至呈負相關(guān),這與前人得出的黃酮類是銀杏葉抗氧化的主要活性成分,內(nèi)酯類沒有明顯的抗氧化作用的結(jié)論相一致[24-26]。前人研究表明,銀杏葉多糖和原花青素同樣具有較強的抗氧化活性[27-28]。甲醇提取液中的多糖和原花青素僅為副產(chǎn)物,即甲醇對銀杏葉多糖和原花青素未能有效地提取,造成甲醇提取液中兩者的含量較低,加上兩者的抗氧化能力存在劑量效應(yīng),導(dǎo)致多糖、原花青素含量與抗氧化能力相關(guān)性不強,甚至表現(xiàn)出一定的負效應(yīng)[29-30]。韓京艷等[30]的研究表明銀杏總黃酮和萜內(nèi)酯清除自由基能力存在著明顯的協(xié)同作用,其中兩者的配比組表現(xiàn)出較強的抗氧化作用,總提取物在同等條件下未表現(xiàn)出明顯的活性。基于此結(jié)論,本研究的甲醇提取液同時含有總黃酮、萜內(nèi)酯、多糖和原花青素等功能性組分除了存在的劑量效應(yīng)外,還可能存在著一定的拮抗作用,導(dǎo)致萜內(nèi)酯、多糖和原花青素的抗氧化能力不強,甚至表現(xiàn)出一定的負效應(yīng)[29-30]。綜上可知,總黃酮是銀杏葉甲醇提取液抗氧化作用的重要物質(zhì)基礎(chǔ)。這一研究結(jié)果為高抗氧化銀杏種質(zhì)的選育提供了有益信息,即在選育高抗氧化銀杏葉用種質(zhì)時,應(yīng)優(yōu)先考慮總黃酮含量。

聚類分析篩選出了高抗氧銀杏雄株,為高含量高活性育種奠定了基礎(chǔ)。基于銀杏葉提取液的抗氧化活性及功能組分含量,通過聚類分析將23個銀杏雄株劃分成4個類群,各類群的功能組分(總黃酮、萜內(nèi)酯、多糖、原花青素)含量和抗氧化能力(DPPH自由基清除率及還原力)各有特點,其中第1類群(6#)總體表現(xiàn)最好,具體表現(xiàn)為總黃酮含量最高,萜內(nèi)酯、多糖、原花青素含量較低,DPPH自由基清除率及總還原力最高,·OH清除率較高,具有作為茶用或抗氧化產(chǎn)品原料推廣的潛力。本研究僅有6#入選高抗氧化單株,下一步需要增加選育材料數(shù)量及雌性種質(zhì)材料來篩選高抗氧化種質(zhì)。值的注意的是,第3類群(18#、19#、20#、21#、23#)的總黃酮、萜內(nèi)酯、原花青素含量最低,多糖含量較低,DPPH自由基清除率清除率、總還原力較低、·OH清除率卻是最高,推測甲醇提取液中可能存在其他能有效清除·OH的功能成分,有待進一步研究[2,29-30]。