負(fù)載褐藻多酚的麥醇溶蛋白納米遞送體系的制備及特性研究

褐藻多酚(phlorotannins,PT)是褐藻中多酚化合物的總稱,分子質(zhì)量大多為126～650 Da的間苯三酚衍生物或聚合物[1]。PT因分子鏈上含有大量的酚羥基而具有抗氧化[2]、抑菌[3]、降血糖[4]等多種生物活性功能,但其對外界因素(如溫度、氧氣含量、光照等)敏感,容易受外界因素的影響發(fā)生聚合或縮合反應(yīng),從而導(dǎo)致PT生物活性降低[5]。研究表明多糖、蛋白質(zhì)等食源性生物大分子作為載體可提高活性物質(zhì)在食品和醫(yī)藥等領(lǐng)域的生物利用率[6-9]。CUI等[10]利用苦瓜多糖作為載體運(yùn)載PT,有效地提高了其穩(wěn)定性。史建如等[11]研究發(fā)現(xiàn)制備負(fù)載PT的納米基具有一定的緩釋效果。但未發(fā)現(xiàn)用蛋白作為載體提高PT的穩(wěn)定性。

植物蛋白質(zhì)具有良好的生物兼容性、生物可代謝性與生物降解性,因此能夠在活性物質(zhì)的遞送系統(tǒng)中得到廣泛的應(yīng)用,如玉米醇溶蛋白,大豆分離蛋白、麥醇溶蛋白等[12]。麥醇溶蛋白是小麥中的主要蛋白質(zhì)之一,約占其總蛋白含量的30%,平均相對分子質(zhì)量為25～100 kDa,在70%～90%的乙醇水溶液中有良好的溶解性[13]。麥醇溶蛋白在溶劑的極性發(fā)生改變時(shí),會通過分子內(nèi)氫鍵、二硫鍵、疏水相互作用等作用力形成類似于球狀的三維結(jié)構(gòu)。許雪兒等[14]研究發(fā)現(xiàn)利用麥醇溶蛋白/阿拉伯膠納米顆粒負(fù)載百里香酚,可改善百里香酚的穩(wěn)定性?？紫檎涞萚15]研究表明麥醇溶蛋白自組裝納米粒有效地提高了白藜蘆醇的穩(wěn)定性。目前尚未有采用麥醇溶蛋白納米粒子運(yùn)載PT的相關(guān)研究報(bào)道。

本研究利用反溶劑法制備麥醇溶蛋白負(fù)載PT的納米粒子(phlorotannins-loaded gliadin nanoparticles,GPNPs),旨在提高PT的穩(wěn)定性,通過考察麥醇溶蛋白與PT不同質(zhì)量比對GPNPs納米粒子粒徑,ζ電位、包埋率、負(fù)載率的影響,并借助傅立葉變換紅外吸收光譜(Fourier transform infrared spectroscopy,FTIR)、X射線衍射(X-ray diffraction,XRD)、透射電子顯微鏡(transmission electron microscope,TEM)等方法研究GPNPs納米粒子的微觀結(jié)構(gòu)及特性,并進(jìn)一步探討麥醇溶蛋白與PT形成納米粒子機(jī)理,以期為提高PT的穩(wěn)定性和生物利用度提供相關(guān)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

褐藻多酚,西安百川生物科技有限公司；麥醇溶蛋白(食品級),源葉生物；胃蛋白酶、胰蛋白酶、無水乙醇(化學(xué)純),國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

UV-2600 紫外可見分光光度計(jì),日本島津公司；NanoPlus 3 Zeta電位與納米粒度儀,美國麥克儀器公司；AVATAR360 型傅里葉紅外光譜,美國尼高力儀器公司；X’pert3 and Empyrean X-射線粉末衍射儀,Netherlands Panalytical；Tecnai G2 F20/F30場發(fā)射透射電子顯微鏡,美國FEI公司；DF101-S 磁力加熱攪拌器,杭州儀表電機(jī)有限公司；HT-110X 系列水浴振蕩器,金壇區(qū)金城春蘭實(shí)驗(yàn)儀器廠；RE-5299旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀,上海圣科儀器設(shè)備有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 GPNPs的制備

稱取粉末狀麥醇溶蛋白4.00 g,加入到100 mL 70%(體積分?jǐn)?shù))乙醇溶液中溶解,在磁力攪拌器中以500 r/min攪拌2 h,制得質(zhì)量濃度400 mg/mL 麥醇溶蛋白溶液。分別取0、10、20、30、40 mL質(zhì)量濃度40 mg/mL的PT溶液與麥醇溶蛋白溶液混合,取上述溶液10 mL以8 mL/h的速度滴入到100 mL水中。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器去除所有乙醇和部分水。最終將溶液儲存在4 ℃下備用,將不同的PT加入量樣品記為GPNPs0、GPNPs1、GPNPs2、GPNPs3、GPNPs4。

圖1 GPNPs制備示意圖

Fig.1 Schematic diagram of the preparation of GPNPs

1.2.2 粒徑和ζ電位分析

用ζ電位與粒度儀測定新鮮懸浮液的粒徑和ζ電位。將懸浮液稀釋10倍,然后調(diào)整pH進(jìn)行分析。每個(gè)試驗(yàn)采用3次獨(dú)立懸液重復(fù)測定,每次測定3次。

1.2.3 PT標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

按照參考文獻(xiàn)[16]的方法制備PT標(biāo)準(zhǔn)曲線及計(jì)算總酚含量,得到PT濃度與吸光值的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.121 6x+0.054 9(R2=0.999 4),根據(jù)此方程計(jì)算PT濃度。測定的總酚含量為137 mg/g。

1.2.4 包埋率和承載率分析

取5 mL納米粒懸浮液于10 mL離心管中,4 000×g離心30 min,取上清液1 mL于10 mL容量瓶,加水稀釋,混勻,加入1.25 mL Folin-Ciocalteu試劑,3 min后加入4 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的Na2CO3溶液,定容至10 mL,混勻,30 ℃避光反應(yīng)60 min,在760 nm波長處測定樣品溶液的吸光度,根據(jù)褐藻多酚標(biāo)準(zhǔn)曲線得到溶液中游離的褐藻多酚的質(zhì)量,空白納米粒溶液作為對照[17]。包封率(encapsulation efficiency,EE)和承載量(loading capacity,LC)分別按公式(1)、公式(2)計(jì)算：

(1)

(2)

式中：m總,褐藻多酚的總投入質(zhì)量,g；m游,游離的褐藻多酚質(zhì)量,g；m微粒,干燥微粒的質(zhì)量,g。

1.2.5 TEM分析

取一滴溶液于銅網(wǎng)上,自然晾干后,用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%磷鎢酸溶液進(jìn)行染色,負(fù)染30 min后,用濾紙吸走多余染液。將銅網(wǎng)置于TEM下觀察并拍照。加速電壓為80 kV。

1.2.6 FTIR分析

將制備得到的復(fù)合物凍干,按質(zhì)量比1∶100的比例與KBr混勻并在瑪瑙研缽中研碎,壓片,用傅立葉紅外光譜儀在波長范圍內(nèi)掃描測定。光譜測定范圍4 000～400 cm-1,儀器分辨率為0.5 cm-1,掃描次數(shù)32次。

1.2.7 XRD分析

將制備得到的復(fù)合物凍干,采用X射線粉末衍射儀分別對PT、GNPS及GPNPs復(fù)合物進(jìn)行光譜掃描分析,掃描角度范圍5～70°,掃描速度為2°/min。

1.2.8 模擬體外消化分析

1.2.8.1 人工胃液(simulated gastric fluid，SGF)的配制

用電子分析天平精確稱量NaCl 2.0 g,將其倒入去離子水中攪拌溶解。再用量筒量取體積分?jǐn)?shù)37%的HCl溶液7.0 mL 緩慢倒入NaCl溶液中。隨后將上述溶液轉(zhuǎn)移到1 L容量瓶中,用去離子水定容。使用pH計(jì)對其進(jìn)行檢測并進(jìn)行相應(yīng)校正,最終獲得pH為1.2的模擬胃液。在GPNPs開始進(jìn)行模擬反應(yīng)前1 h將胃蛋白酶Pepsin(3.2 g/L,3 000 NFU/g)溶解于模擬胃液中。

1.2.8.2 人工腸液(simulated intestinal fluid，SIF)的配制

用電子分析天平精確稱量NaOH 4.0 g,將其倒入去離子水中攪拌溶解,再轉(zhuǎn)移到500 mL的容量瓶中,定容備用。用電子分析天平精確稱量磷酸二氫鉀6.8 g,將其倒入250 mL去離子水中攪拌溶解。再用量筒量取上述配制好的0.2 mol/L NaOH標(biāo)準(zhǔn)液190 mL緩慢倒入磷酸二氫鉀溶液中。隨后將上述溶液轉(zhuǎn)移到1 L容量瓶中,用去離子水定容。使用pH計(jì)對其進(jìn)行檢測并進(jìn)行相應(yīng)校正,最終獲得 pH為7.4的模擬腸液。在GPNPs開始進(jìn)行模擬反應(yīng)前1 h將胰蛋白酶 Trypsin(3.2 g/L,250 NFU/mg)溶解于模擬腸液中。

取2 mL納米粒子溶液于15 mL離心管中,并加入8 mL模擬液(或腸液),將得到的混合液放在37 ℃的恒溫?fù)u床中以100 r/min振蕩,在不同時(shí)間取出離心管,以8 000 r/min離心5 min,取1.0 mL,加水稀釋,加入1.25 mL Folin-Ciocalteu試劑,混勻,3 min后加入4.0 mL質(zhì)量濃度0.1 g/mL NaCO3溶液,加水定容至10 mL,混勻,30 ℃避光反應(yīng)60 min,在760 nm處測定吸光度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和稀釋倍數(shù)計(jì)算PT的含量[18]。

1.2.9 DPPH清除率分析

準(zhǔn)確稱取50 mg納米粒子粉末樣品,加入5 mL純水并攪拌1 h。配制質(zhì)量濃度40 mg/L的DPPH乙醇溶液,避光攪拌。將1 mL樣品溶液或純水與2 mL DPPH溶液混合并振蕩,常溫避光儲存30 min。將此混合液在517 nm處通過測定吸光值檢測殘留的DPPH自由基[9]。納米粒子的DPPH自由基清除率通過公式(3)計(jì)算：

DPPH自由基清除率

(3)

式中：A樣,樣品混合DPPH溶液后的吸光值；A水,純水混合DPPH溶液后的吸光值；最終結(jié)果取3次測量的平均值。

1.3 數(shù)據(jù)分析

所有試驗(yàn)均進(jìn)行3次平行試驗(yàn),數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0和Excel 2016軟件進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 GPNPs的粒徑和ζ電位

GPNPs的粒徑和ζ電位如表1所示,GPNPs0的粒徑為(166.20±5.03)nm,與文獻(xiàn)所報(bào)道的一致[19]。隨著PT含量的增大,GPNPs1、GPNPs2、GPNPs3粒徑與GPNPs0的粒徑大小基本一致,約為170 nm,但分散指數(shù)值不穩(wěn)定,分別為(0.41±0.03)、(0.46±0.01)、(0.34±0.01)(P<0.5),GPNPs4的粒徑增大至(346.70±5.13)nm。GPNPs0的Zeta電位為(15.95±0.04)mV,隨著PT加入,其Zeta電位有所下降,GPNPs1、GPNPs2、GPNPs3的ζ電位基本一致,約為14.00 mV,但GPNPs4的ζ電位為(12.83±0.28)mV,可能由于PT的含量過高,部分PT未被包埋在粒子內(nèi),而是附著在粒子表面和游離在體系中,導(dǎo)致其粒徑增大和體系穩(wěn)定性下降[20]。

表1 不同麥醇溶蛋白與褐藻多酚比例對納米粒子的粒徑、多分散性系數(shù)、ζ電位的影響

Table 1 Influence of ratios of G to PT on the particle size, polydispersity coefficient, and ζ potential of nanoparticles

注：不同字母表示不同樣品具有差異顯著性(P<0.05)；表中G表示麥醇溶蛋白(下同)

2.2 GPNPs的包埋率和承載率

GPNPs的包埋率和承載率如圖2所示,GPNPs1的包埋率為55.4%,隨著PT含量的增大,其包埋率也在增大,但GPNPs3的包埋率最大,為71.7%,GPNPs4包埋率有所下降,為66.4%。可能由于GPNPs3包埋率達(dá)到最大,繼續(xù)添加過量的PT,麥醇溶蛋白無法包埋,這與樊永康等[21]的研究結(jié)果一致。粒子的粒徑和ζ電位在GPNPs4也發(fā)生了變化,與粒子包埋情況相吻合。復(fù)合物的承載率隨著PT含量的增大而增大,從8.6 %升至34.8%。

圖2 PT的包埋率及承載率

Fig.2 Embedding rate and carrying rate of PT

2.3 GPNPs的TEM

GPNPs的TEM如圖3所示,其納米粒子呈類球形或圓球形,大小均一,分布均勻?？赡苡捎谕干潆娮语@微鏡是將樣品干燥后進(jìn)行檢測的,而馬爾文粒徑儀是檢測納米粒子水合狀態(tài)下的尺寸,所以透射電子顯微鏡檢測到的粒子與馬爾文粒徑儀檢測的粒子尺寸相比更小[22]。

圖3 GPNPS的TEM圖像

Fig.3 TEM images of GPNPS

2.4 GPNPs的FTIR

使用FTIR在波長4 000～400 cm-1內(nèi)測量樣品的紅外吸收光譜,包括單純物質(zhì)及復(fù)合物的紅外光譜如圖4所示。在PT譜圖中,3 387 cm-1處為O—H的伸縮振動；2 928 cm-1處為C—H伸縮振動；1 625 cm-1處為CO伸縮振動；1 446 cm-1處為芳環(huán)骨架CC的伸縮振動吸收帶；857、776、699、569 cm-1處為芳環(huán)C—H面外彎曲振動峰[23]。在麥醇溶蛋白的譜圖中,3 280 cm-1處為酰胺Ⅲ帶,氫鍵和N—H伸縮振動；2 937 cm-1處為脂肪族C—H伸縮振動；1 640 cm-1處為酰胺I帶,CO伸縮振動；1 528 cm-1處為酞胺II帶,C—N伸縮振動與N—H彎曲振動；1 446 cm-1處為CH3、CH2、CH的彎曲振動；1 230 cm-1處為色氨酸或脂肪族C—H彎曲振動[24]。在GPNPs圖中,氫鍵和N—H伸縮振動由3 280移至3 275 cm-1,C—H伸縮振動由2 937移至2 932 cm-1,C—N伸縮振動與N—H彎曲振動由1 528移至1 536 cm-1,這表明PT,可能通過氫鍵、疏水作用等作用力與麥醇溶蛋白發(fā)生相互作用。但在GPNPs譜圖中無苯環(huán)骨架等特征吸收峰,這表明麥醇溶蛋白已經(jīng)成功包裹了PT[21]。

圖4 麥醇溶蛋白、PT、GPNPS的FTIR圖

Fig.4 FTIR spectra of gliadin,PT,GPNPs

2.5 GPNPs的XRD

圖5比較了純的PT、麥醇溶蛋白和GPNPs復(fù)合物的XRD譜圖。PT的主要衍射峰位于16.1、18.5和23.4,表明PT有結(jié)晶度,而麥醇溶蛋白的XRD譜圖中,未出現(xiàn)明顯的峰,表明麥醇溶蛋白的結(jié)晶度較低。PT的晶體射峰未在GPNPs復(fù)合物中出現(xiàn),這表明PT被包埋在麥醇溶蛋白納米粒子內(nèi),以無定型態(tài)的方式分布在納米粒子中[25]。

圖5 麥醇溶蛋白、PT、GPNPS的XRD圖

Fig.5 XRD spectra of gliadin、PT、GPNPs

2.6 GPNPs的模擬體外消化

GPNPs在SGF、SIF中的累積釋放效果如圖6,在SGF中,GPNPs4在120 min累計(jì)釋放率達(dá)到55%,而GPNPs1、GPNPs2、GPNPs3累計(jì)釋放率約為40%。這可能與圖2粒子的包埋率有關(guān)。

a-GPNPs在SGF中的累計(jì)釋放率；b-GPNPs在SIF中的累計(jì)釋放率

圖6 GPNPs的體外消化模擬圖

Fig.6 In vitro digestion simulation of GPNPs

由圖6可知,隨著時(shí)間的延長,復(fù)合粒子的累計(jì)釋放速率有所減緩,且GPNPs4與其他組的差距縮小。在480 min后,累計(jì)釋放率無顯著性差異,且復(fù)合粒子達(dá)到穩(wěn)定釋放的狀態(tài),GPNPs3累計(jì)釋放率約為75%,略高于其他3組。在SIF中,GPNPs在30 min內(nèi)表現(xiàn)出突釋行為,GPNPs1、GPNPs4累計(jì)釋放率分別達(dá)到41%、52%。在30 min后,GPNPs的釋放速率有所減緩,各組之間的差距也在不斷縮小。在720 min后,GPNPs達(dá)到穩(wěn)定釋放的狀態(tài),GPNPs4累計(jì)釋放率最高,約為93%,GPNPs1和GPNPs2累計(jì)釋放率無明顯差異,約為87%。隨著時(shí)間的增長,其PT累計(jì)釋放率處于一個(gè)穩(wěn)定的水平,這與PT在溶劑中的溶解度、麥醇溶蛋白的穩(wěn)定性、PT與麥醇溶蛋白之間的相互作用力及麥醇溶蛋白對PT的包埋程度等多種因素有關(guān)[26]。在SGF、SIF中,一開始的突釋行為可能是GPNPs中存在未完全包埋的PT及負(fù)載在粒子表面的PT,這2種PT的存在方式作用力較弱,容易釋放到溶劑中。

2.7 GPNPs的DPPH自由基清除率

PT對環(huán)境的敏感性非常高,PT抗氧化性容易受到影響。GPNPs復(fù)合物的自由基清除率如圖7所示,在沒有加入PT時(shí),單純的GNPs的自由基清除率為3.34%,說明麥醇溶蛋白也有一定的抗氧化能力。隨著PT量的增大,自由基清除率也不斷的升高,GPNPs4自由基清除率達(dá)到了47.06%,表明包埋后的PT仍具有一定抗氧化活性[27]。

圖7 GPNPs的DPPH自由基清除率

Fig.7 DPPH free radical scanvenging rate of GPNPs

3 結(jié)論

利用麥醇溶蛋白包埋PT,提高了PT的穩(wěn)定性。通過納米粒度儀研究GPNPs的納米直徑分布、ζ電位,確定麥醇溶蛋白與PT的最優(yōu)結(jié)合體積比為1∶0.3,形成粒徑為166 nm的納米粒子。TEM和XRD研究結(jié)果表明PT被麥醇溶蛋白包埋在粒子中。FTIR結(jié)果表明麥醇溶蛋白與PT結(jié)合后,兩者之間發(fā)生了相互作用力。體外模擬消化研究表明,GPNPs有緩慢釋放的效果,減慢了釋放速率,提高了PT在人體內(nèi)的消化利用率。研究表明,麥醇溶蛋白可以降低PT在食品加工、運(yùn)輸和消化吸收中降解和損失率,是一種極具潛力的納米遞送系統(tǒng)。