脂質(zhì)包衣的姜黃素/玉米醇溶蛋白納米粒的制備及性能表征

姜黃素是一種來(lái)源于姜黃的疏水性植物多酚,具有抗氧化、抗炎、抗菌、抗癌等多種生物活性[1-2]。然而由于遇光熱不穩(wěn)定、胃腸道穩(wěn)定性差等原因,姜黃素的口服生物利用度偏低,嚴(yán)重影響其在食品及醫(yī)藥工業(yè)領(lǐng)域的應(yīng)用[1,3-4]。近幾十年來(lái),相關(guān)領(lǐng)域開(kāi)發(fā)出了一系列的遞送體系,通過(guò)將姜黃素負(fù)載于脂質(zhì)體、乳液、環(huán)糊精、聚合物納米粒等載體內(nèi),提高姜黃素的水分散性、理化穩(wěn)定性以及生物利用度[5-8]。

玉米醇溶蛋白(zein)是一種來(lái)源于玉米的食品級(jí)天然高分子材料,具有來(lái)源廣泛、生物相容性好、生物可降解等優(yōu)點(diǎn)[9-10]。同時(shí)zein還具有兩親性,雖不溶于水,但能夠在水中形成納米尺寸的膠體,是一種天然的納米載體材料[11-13]。由于其獨(dú)特的疏水性,zein表現(xiàn)出良好的隔絕水、熱、氧等極端外部環(huán)境的性質(zhì),特別適合于易氧化水解的生物活性分子的負(fù)載,如姜黃素、維生素D3等[11,14-15]。然而通過(guò)溶劑共沉淀法得到的zein納米粒,穩(wěn)定性差,極易在水中團(tuán)聚,造成活性物質(zhì)的沉淀；同時(shí)易被食品或胃腸道中的蛋白酶降解,導(dǎo)致活性物質(zhì)的泄露或失活。在制備過(guò)程中引入穩(wěn)定劑,如表面活性劑、親水性高分子等,可以改善zein納米粒在不同pH下的分散性和穩(wěn)定性[16-18]。

磷脂是不溶于水的雙親性小分子,在水中能夠自組裝形成脂質(zhì)體[19]。將脂質(zhì)體與納米粒共擠出,可以將磷脂涂敷于納米粒表面[20-21]。經(jīng)脂質(zhì)包衣后的納米粒,不僅在不同pH環(huán)境、血液及體液中穩(wěn)定性顯著提高,同時(shí)具備脂質(zhì)體的優(yōu)良特性,如細(xì)胞毒性低、細(xì)胞親和性高、表面抗原性低、體內(nèi)循環(huán)時(shí)間長(zhǎng)等[22-24]。

本實(shí)驗(yàn)以zein為載體材料制備負(fù)載姜黃素的納米粒,并利用共擠出的方法,在納米粒表面涂敷一層磷脂殼層,從而得到脂質(zhì)包衣的姜黃素/zein納米粒,如圖1所示。接著對(duì)納米粒進(jìn)行穩(wěn)定性表征,研究納米粒在脂質(zhì)包衣前后不同pH環(huán)境下的穩(wěn)定性以及負(fù)載前后姜黃素的光熱穩(wěn)定性和抗氧化性,然后進(jìn)一步表征了姜黃素納米粒的體外釋放特性。

圖1 脂質(zhì)包衣zein/姜黃素納米粒制備流程圖

Fig.1 Schematic illustration for the fabrication of lipid coated zein/curcumin nano-complexation

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

姜黃素、膽固醇、DPPH,上海阿拉丁生化科技股份有限公司；玉米醇溶蛋白,北京伊諾凱科技有限公司；氫化大豆卵磷脂,艾偉拓(上海)醫(yī)藥科技有限公司；其余有機(jī)溶劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Zeta電位及納米/亞微米粒度分析儀,美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特有限公司；SpectraMax iD3 多功能酶標(biāo)儀,美國(guó)美谷分子儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 負(fù)載姜黃素的zein納米粒(NP)的制備

利用共沉淀法制備包裹姜黃素的zein納米粒[25]。以體積分?jǐn)?shù)為80%的乙醇溶液為溶劑,配制一系列質(zhì)量濃度(2～20 mg/mL)的zein溶液。將姜黃素溶解于無(wú)水乙醇中,質(zhì)量濃度為2 mg/mL。將2種溶液等體積混合均勻,采用“一針?lè)ā笨焖俅蛉?0 mmol/L的PB緩沖液(pH 4)中,繼續(xù)攪拌30 min,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去混合溶液中殘余乙醇,即得NP混懸液。

1.3.2 脂質(zhì)體的制備

采用乙醇注入法制備脂質(zhì)體[26]。將氫化大豆卵磷脂和膽固醇共溶于無(wú)水乙醇中,其中氫化大豆卵磷脂質(zhì)量濃度為3 mg/mL,膽固醇質(zhì)量濃度為1 mg/mL,邊攪拌邊將溶液緩慢注入雙蒸水中,水油體積比為6∶1,繼續(xù)攪拌30 min,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去混合溶液中殘余的乙醇,即得脂質(zhì)體混懸液。

1.3.3 脂質(zhì)包衣納米粒的制備

采用共擠出的方法制備脂質(zhì)包衣的納米粒[20]。將NP混懸液與脂質(zhì)體混懸液等體積混合,并將混合溶液擠壓通過(guò)100 nm的濾膜,重復(fù)擠出15次,即得到脂質(zhì)包衣的納米粒(NP@LIP)。

1.3.4 顆粒粒徑及表面電位表征

利用Zeta電位及納米/亞微米粒度分析儀測(cè)量顆粒的粒徑、粒徑分布及表面電位。重復(fù)測(cè)量3次取平均值。

1.3.5 包封率及載藥量的測(cè)量

采用離心法進(jìn)行包封率及載藥量的測(cè)量。取2 mL的納米粒混懸液,在10 000 r/min轉(zhuǎn)速下離心30 min,未包裹的姜黃素離心至底部,棄去上清液,加入2 mL的乙醇溶液將沉淀復(fù)溶,并利用多功能酶標(biāo)儀測(cè)量428 nm處的紫外吸收以得到姜黃素的質(zhì)量濃度。通過(guò)公式(1)和公式(2)計(jì)算得出包封率和載藥量：

包封率

(1)

載藥量

(2)

1.3.6 不同pH水分散性表征

將制備好的納米粒混懸液與5倍體積的不同pH的PB緩沖液(pH 2.5、4.5、5.5、6.6、7.4)均勻混合,室溫下孵育4 h后,測(cè)量其粒徑及粒徑分布。

1.3.7 光照穩(wěn)定性表征

將10 mL納米粒混懸液或姜黃素水混懸液暴露于紫外光(0.3 W/m2,波長(zhǎng)305 nm)中,每隔1 h取出200 μL混懸液與800 μL乙醇混合以破壞納米粒,并測(cè)量姜黃素的質(zhì)量濃度。

1.3.8 熱穩(wěn)定性表征

將10 mL納米?；鞈乙阂约敖S素水混懸液在80 ℃下進(jìn)行孵育,每隔1 h取出200 μL混懸液與800 μL乙醇混合以破壞納米粒,并測(cè)量姜黃素的質(zhì)量濃度。

1.3.9 體外抗氧化性表征

通過(guò)DPPH自由基清除實(shí)驗(yàn)表征姜黃素納米粒的體外抗氧化性能[18]。配制一系列質(zhì)量濃度的姜黃素乙醇溶液、姜黃素水混懸液、NP混懸液、NP@LIP混懸液以及不含姜黃素的脂質(zhì)包衣的zein納米粒混懸液作為待測(cè)樣品。將2 mL的DPPH乙醇溶液(100 μmol/L)與等體積的待測(cè)樣品混合,避光、室溫下孵育30 min,利用酶標(biāo)儀測(cè)量混合液在570 nm處的吸光度,并利用公式(3)計(jì)算得出樣品的DPPH自由基清除率：

DPPH自由基清除率

(3)

式中：A0,空白孔的吸光度;A1,樣品孔的吸光度。

1.3.10 體外釋放實(shí)驗(yàn)

采用動(dòng)態(tài)透析法在模擬胃腸道環(huán)境下進(jìn)行姜黃素的體外釋放實(shí)驗(yàn)[27]。以含有5% SDS的模擬胃液(pH 2.5,1 mg/mL胃蛋白酶)和含有5%SDS的模擬腸液(pH 6.6,4 mg/mL胰蛋白酶)為釋放介質(zhì)。取1 mL的NP、NP@LIP混懸液及姜黃素乙醇溶液置于透析袋內(nèi)(截留分子質(zhì)量=300 kDa),浸入20 mL的釋放介質(zhì)中,在37 ℃的搖床中孵育。前2 h以模擬胃液為釋放介質(zhì),2 h后轉(zhuǎn)移入模擬胃液中繼續(xù)進(jìn)行釋放實(shí)驗(yàn)。在特定的時(shí)間點(diǎn)取出1 mL透析液,利用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)量姜黃素含量,并計(jì)算得出姜黃素的累積釋放量。

1.3.11 數(shù)據(jù)分析與處理

所有數(shù)據(jù)均為3次平行實(shí)驗(yàn)結(jié)果的平均值,標(biāo)準(zhǔn)差以誤差線表示。采用雙尾學(xué)生t檢驗(yàn)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析(SPSS),P<0.05時(shí),認(rèn)為兩組數(shù)據(jù)具有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 脂質(zhì)包衣姜黃素/zein納米粒的構(gòu)建

利用圖1中所示的兩步法來(lái)構(gòu)建脂質(zhì)包衣的姜黃素/zein納米粒。第1,通過(guò)納米沉淀法制備NP,將姜黃素的質(zhì)量濃度固定為1 mg/mL,考察了水油比對(duì)NP的影響,結(jié)果如圖2-a所示。水油比<3時(shí),姜黃素與zein只能形成較大的納米粒(>200 nm)或沉淀;隨水油比從4升高至9,NP粒徑先由75 nm降低至64 nm后又升高至139 nm,(polydispersit index,PDI)由0.315降低至0.11。為了得到較小粒徑的納米粒及較高的固含量,選取水油比為6作為最優(yōu)制備條件。圖2-b為zein濃度對(duì)NP的影響。當(dāng)zein質(zhì)量濃度為2 mg/mL時(shí),溶液出現(xiàn)大量沉淀,說(shuō)明此濃度下,沒(méi)有足夠的zein對(duì)姜黃素進(jìn)行有效包裹。當(dāng)zein質(zhì)量濃度高于4 mg/mL時(shí),粒徑為60～130 nm,同時(shí)粒徑分布均勻(PDI<3)的納米混懸液。圖2-c所示為不同zein濃度下姜黃素的包封率和載藥量。隨zein濃度提高,包封率逐漸由56%提高至90%左右,載藥量先由12%升高至16%后又逐漸降低至6%,當(dāng)zein質(zhì)量濃度為6 mg/mL時(shí),載藥量最大,對(duì)姜黃素的包載效果最好,因此選取zein質(zhì)量濃度6 mg/mL作為最優(yōu)的制備條件。

第2步,通過(guò)脂質(zhì)體與第1步制備得到的NP納米核心共擠出的方法構(gòu)建脂質(zhì)包衣的納米粒(NP@LIP)。如圖2-d所示,NP的初始粒徑和表面電位分別為60 nm和29 mV,共擠出后,納米混懸液的粒徑增大至70 nm,同時(shí)表面電位轉(zhuǎn)變?yōu)?7 mV,與空白脂質(zhì)體的表面電位接近,由此說(shuō)明,經(jīng)共擠出,成功制備得到了脂質(zhì)包衣的納米粒(NP@LIP)。相比于表面涂敷表面活性劑或親水性高分子的zein納米粒體系[16-18],NP@LIP具備較高的包封率(80.1%)和載藥量(7.4%)。

a-不同水油體積比下NP的粒徑, PDI, Zein濃度=6 mg/mL; b-不同zein濃度下NP的粒徑、PDI，油水比=6; c-不同zein濃度下NP中姜黃素的包封率和載藥量; d-空白脂質(zhì)體、NP及NP@LIP的粒徑及表面電位

圖2 NP及NP@LIP制備條件優(yōu)化

Fig.2 Optimization of the fabrication of NP and NP@LIP

2.2 pH穩(wěn)定性

如圖3所示,研究了不同pH下,NP及NP@LIP的水分散性能。隨溶液pH逐漸接近6.1,NP粒徑逐漸增大,甚至發(fā)生沉淀。這是由于zein的等電點(diǎn)在6.1左右,當(dāng)pH接近等電點(diǎn)時(shí),NP表面電位下降,顆粒間容易發(fā)生聚集,甚至沉淀,水分散性下降[28]。當(dāng)pH由2.5升高至7.4時(shí),NP@LIP粒徑雖略有增大,但仍保持良好的水分散性,這是由于NP@LIP具有脂質(zhì)殼層作為保護(hù),阻礙了顆粒間的聚集。以殼聚糖、酪蛋白酸鈉等親水性多糖或蛋白為穩(wěn)定劑的zein納米粒體系[29],其表面層分子的解離狀態(tài)及表面電位極易受到pH變化的影響,導(dǎo)致其在不同pH環(huán)境中的穩(wěn)定性具有較大差異。相比之下,脂質(zhì)表面層的解離受pH影響較小,能夠在較寬廣的pH范圍內(nèi)保持良好的水分散性。

圖3 不同pH條件下NP及NP@LIP的粒徑

Fig.3 Size of NP and NP@LIP under different pH

2.3 紫外光照穩(wěn)定性

探究了不同姜黃素納米粒在紫外光照條件下的穩(wěn)定性,結(jié)果如圖4所示。未經(jīng)包裹的姜黃素含量隨光照時(shí)間迅速降低,4 h時(shí)僅剩余18%；NP及NP@LIP顆粒中姜黃素含量隨時(shí)間降低較為緩慢,4 h時(shí)仍有57%的姜黃素剩余,表明經(jīng)過(guò)負(fù)載后,姜黃素表現(xiàn)出更好的光照穩(wěn)定性,這主要是由于zein的保護(hù)作用,磷脂涂覆層對(duì)姜黃素穩(wěn)定性影響較小,該結(jié)果與其他研究類似[30]。

圖4 不同姜黃素納米粒中姜黃素的紫外光照穩(wěn)定性

Fig.4 Light stability of curcumin in different formulations under UV irradiation

注：*P<0.05;**P<0.01;***P<0.001 CUR=姜黃素(下同)

2.4 熱穩(wěn)定性

探究了不同姜黃素納米粒在高溫(85 ℃)條件下的穩(wěn)定性,結(jié)果如圖5所示。未經(jīng)包裹的自由姜黃素穩(wěn)定性最差,2 h內(nèi)即有70%的姜黃素?fù)p耗,10 h時(shí)基本全部降解。由于zein具有隔絕熱、氧等極端環(huán)境條件的作用,NP中姜黃素表現(xiàn)出較好的穩(wěn)定性,10 h時(shí)還剩余25.8%。NP@LIP表現(xiàn)出最好的熱穩(wěn)定性,10 h時(shí),仍保留有35.7%的姜黃素。相比于NP,經(jīng)脂質(zhì)包衣后,NP@LIP的姜黃素?zé)岱€(wěn)定性(熱處理后剩余的姜黃素量)提高了約10%。其他類似研究也發(fā)現(xiàn),相較于單純的zein/姜黃素納米粒,表面涂敷不同物質(zhì)及結(jié)構(gòu)的保護(hù)層后,姜黃素的熱穩(wěn)定性提升5%～12%[12-13]。由此說(shuō)明,脂質(zhì)殼層的引入能夠進(jìn)一步改善zein納米粒中姜黃素的熱穩(wěn)定性,達(dá)到文獻(xiàn)報(bào)道的水平[12-13]。

圖5 不同姜黃素納米粒中姜黃素在85 ℃條件下的熱穩(wěn)定性

Fig.5 Heat stability of curcumin in different formulations

2.5 抗氧化性

姜黃素是一類具備良好抗氧化活性的多酚類物質(zhì),然而較差的水溶性嚴(yán)重影響了姜黃素在生理環(huán)境下的抗氧化性能。通過(guò)將姜黃素納米制劑化,改善其水分散性,顯著提高姜黃素在水環(huán)境下的抗氧化能力[12]。通過(guò)DPPH自由基清除實(shí)驗(yàn)研究了不同姜黃素納米粒的體外抗氧化性能,如圖6所示?？瞻最w粒,即脂質(zhì)包衣的zein納米粒,在實(shí)驗(yàn)濃度范圍基本無(wú)抗氧化活性,排除了載體材料對(duì)抗氧化性能的影響。由于姜黃素水溶性較差,在0.1～450 μg/mL的濃度范圍內(nèi),姜黃素水混懸液的自由基清除率均遠(yuǎn)低于姜黃素乙醇溶液、NP以及NP@LIP,抗氧化活性最差。經(jīng)zein包裹后,姜黃素水分散性提高,其抗氧化活性優(yōu)于水混懸液。

圖6 不同姜黃素納米粒的體外抗氧化性能

Fig.6 Antioxidation activity of different curcumin formulation

NP@LIP的抗氧化活性明顯高于NP,這是由于脂質(zhì)包衣層賦予了NP@LIP更好的水分散性以及穩(wěn)定性,促進(jìn)了姜黃素與DPPH自由基的充分接觸,表現(xiàn)出與姜黃素乙醇溶液相似的抗氧化能力。

2.6 體外釋放行為

通過(guò)不同姜黃素納米粒的體外胃腸道模擬釋放行為研究口服后姜黃素的小腸遞送效率。胃排空時(shí)間約為2 h,因此初始2 h在模擬胃液中進(jìn)行釋放實(shí)驗(yàn),而后轉(zhuǎn)移至模擬腸液,以模擬姜黃素顆粒在整個(gè)口服過(guò)程中的釋放行為。結(jié)果如圖7所示,未經(jīng)包裹的自由姜黃素、NP以及NP@LIP在模擬胃液中表現(xiàn)出不同程度的突釋,自由姜黃素突釋最為嚴(yán)重,2 h時(shí)有一半以上的姜黃素被釋放出來(lái)；經(jīng)zein負(fù)載后,NP的姜黃素突釋較為平緩,2 h時(shí)僅有38%的姜黃素釋放量；NP@LIP姜黃素的突釋量最小,2 h時(shí)僅有27%,這可能是由于顆粒表面的磷脂層進(jìn)一步阻止了姜黃素的釋放。在進(jìn)入模擬腸液后,自由姜黃素的釋放速率基本不變,直至4 h基本釋放完全；而NP及NP@LIP的釋放速率顯著減小,表現(xiàn)出明顯的緩釋的特征,且在24 h內(nèi)基本釋放完全,累積釋放量分別為78%和76%。由此可知,脂質(zhì)包衣的姜黃素/zein納米粒具備良好的胃部保護(hù)效果,防止姜黃素在胃部泄露,同時(shí)在小腸中能夠?qū)崿F(xiàn)姜黃素的緩釋。

圖7 不同姜黃素納米粒在體外模擬胃腸液中的釋放行為

Fig.7 Controlled release behavior of curcumin in different formulations in SGF and SIF

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)以磷脂及玉米醇溶蛋白為載體材料,采用共沉淀法及共擠出法成功制備了脂質(zhì)包衣的負(fù)載姜黃素納米粒,制得的納米粒粒徑微小、分布均勻同時(shí)具有較高的包封率及載藥量。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)脂質(zhì)包衣的姜黃素納米粒在較廣pH范圍內(nèi)均保持良好的水分散性,同時(shí)包裹后姜黃素的光熱穩(wěn)定性以及抗氧化性也獲得顯著提高。體外釋放實(shí)驗(yàn)表明,脂質(zhì)包衣的納米粒能夠更有效地阻止姜黃素在胃部的泄露,提高姜黃素口服遞送至小腸的效率。本文構(gòu)建的基于磷脂及玉米醇溶蛋白的核殼結(jié)構(gòu)納米遞送體系能夠顯著提高姜黃素的理化性質(zhì)和口服遞送效率,極大地?cái)U(kuò)展了姜黃素在食品工業(yè)及生物醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用,同時(shí)還為疏水生物活性物質(zhì)的性能改善及口服制劑提供了新的思路和方法。