不同類型的凝固劑對(duì)豆腐中蛋白質(zhì)消化特性的影響

豆腐是以大豆蛋白為骨架,在凝固劑作用下形成的三維網(wǎng)絡(luò)狀凝膠。傳統(tǒng)豆腐制作是向經(jīng)過熱處理的豆?jié){中加入適當(dāng)?shù)哪虅┦蛊淠Y(jié)形成膠狀凝乳,再經(jīng)倒模、壓制成型等步驟制作而成。豆?jié){的凝固過程是豆腐生產(chǎn)中最重要的步驟,而不同種類的凝固劑會(huì)最終影響豆腐的產(chǎn)量和質(zhì)量[1]。常見的豆腐凝固劑可分為鹽類凝固劑(如鎂鹽、鈣鹽等),酸類凝固劑[如葡萄糖酸內(nèi)酯(glucono-δ-lactone,GDL)]以及酶類凝固劑(如谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶,TG酶)等[2-5]。我國(guó)市售豆腐主要有3種,分別為南豆腐(多用CaSO4制作而成)、北豆腐(多用MgCl2制作而成)和內(nèi)酯豆腐(GDL豆腐)。

凝固劑的種類和添加量對(duì)豆腐的得率、結(jié)構(gòu)和風(fēng)味有較為顯著的影響。在豆腐品質(zhì)方面,MgCl2能夠極大保留大豆原有的風(fēng)味,產(chǎn)生令人愉悅的香氣,但由于其與豆乳的反應(yīng)非常迅速,導(dǎo)致蛋白網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)收縮、脫水,最終成品豆腐的持水性較差,質(zhì)地粗糙,口感較硬。CaSO4與豆乳反應(yīng)較慢,形成的豆腐結(jié)構(gòu)光滑細(xì)膩,持水性較好,但CaSO4無法完全溶解,容易造成成品豆腐中殘存部分CaSO4,使得豆腐口感略有苦澀,缺乏豆香味。GDL加入熟豆?jié){后,會(huì)緩慢釋放H+,可以促使變性大豆蛋白凝聚,形成凝膠,其制成的豆腐口感軟嫩,但硬度較差,口味平淡,略帶酸味[6]。單一的凝固劑在使用時(shí)各有優(yōu)缺點(diǎn),而復(fù)合凝固劑是隨機(jī)自動(dòng)化,機(jī)械化以及工業(yè)化的發(fā)展而產(chǎn)生的,不僅可以克服單一凝固劑的缺點(diǎn),而且還可使產(chǎn)品有更好的質(zhì)地。

體內(nèi)評(píng)估和體外模擬是研究食物消化的常用方法。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)可以準(zhǔn)確地反映食物消化過程中的真實(shí)情況,但往往存在費(fèi)用高、重現(xiàn)性差、受倫理道德約束等問題[7]。體外消化是以生物體胃腸道生理情況為依據(jù),將物質(zhì)在可控的環(huán)境下進(jìn)行消化的過程,可以在一定程度上代表物質(zhì)在生物體內(nèi)的變化,具有簡(jiǎn)單、快速、費(fèi)用低、可重復(fù)等優(yōu)點(diǎn),與體內(nèi)消化模型相比,其在模擬人體胃腸道生理?xiàng)l件下研究食物攝入后結(jié)構(gòu)變化及消化率的有效途徑。且有諸多研究指出運(yùn)用體外模擬消化的方法測(cè)定的結(jié)果與體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果有很好的相關(guān)性[8-9]。因此,體外胃腸道消化在蛋白質(zhì)的研究中得到廣泛使用。

本論文擬采用單一的鹽類凝固劑CaSO4、酸類凝固劑GDL及二者的復(fù)合凝固劑制作豆腐,采用體外模擬人體胃腸道消化模型來判斷不同凝固劑制作的豆腐中大豆蛋白消化特性的區(qū)別,從可溶性蛋白含量、小肽、蛋白質(zhì)消化率、水解度、SDS-PAGE等方面進(jìn)行分析。通過體外胃腸道消化的方法比較測(cè)定使用哪種凝固劑更利于豆腐蛋白的消化吸收,從而確定較優(yōu)品質(zhì)的豆腐凝固劑類型,以此來改善人們的健康和飲食。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆,購于超市；豆?jié){消泡劑、石膏凝固劑,安琪酵母有限公司；GDL,江西新黃海食品有限公司；甲醇、無水乙醇、乙酸、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、丙三醇、磷酸、鹽酸、乙酸,均為分析純,江蘇強(qiáng)盛功能化學(xué)股份有限公司；(羥甲基)氨基甲烷,上海強(qiáng)順化學(xué)試劑有限公司；溴酚藍(lán)、牛血清白蛋白、考馬斯亮藍(lán)R250、考馬斯亮藍(lán)G250,福州飛凈生物科技有限公司；十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate,SDS)、甘氨酸、十水合四硼酸鈉、鄰苯二甲醛(O-phthalaldehyde,OPA),上海羅恩化學(xué)技術(shù)有限公司；L-絲氨酸、胰酶粉(P7 340)、胃蛋白酶1∶3 000(P8 390)、豬膽鹽(G8 310)、β-巰基乙醇,北京索萊寶科技有限公司；α-淀粉酶(酶活力50 000 U/g),河北萬達(dá)生物工程有限公司；胰蛋白酶1∶400(豬胰),上海瑞永生物科技有限公司；糜蛋白酶(酶活力1 500 U/mg)、肽酶(酶活力2 000 U/g),上海源葉生物科技有限公司；二硫蘇糖醇(dithiothreitol,DTT)、彩色蛋白Marker(15～130 kDa)、SDS-PAGE凝膠快速制備試劑盒,北京蘭杰柯科技有限公司；超濾離心管10 kDa,Millipore密理博。

1.2 儀器與設(shè)備

MC-15K微型高速離心機(jī),杭州佑寧儀器有限公司；Vortex-2漩渦混勻儀,上海葉拓科技有限公司；恒溫振蕩器,上海一恒科學(xué)儀器有限公司；FE20實(shí)驗(yàn)室pH計(jì),上海梅特勒-托利多儀器有限公司；九陽破壁機(jī),九陽股份有限公司；美的電磁爐,美的股份有限公司；UV1 800紫外可見分光光度計(jì),上海美譜達(dá)儀器有限公司；Mini-protean型電泳儀,美國(guó)伯樂公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 凝固劑的選擇與復(fù)配

分別選用鹽類凝固劑CaSO4(添加量為6 g/L),酸類凝固劑GDL(添加量為3 g/L)以及兩者復(fù)配(CaSO4添加量為3 g/L,GDL添加量為1.5 g/L)進(jìn)行豆腐的制作。

1.3.2 豆腐的制作

挑選顆粒飽滿的優(yōu)質(zhì)大豆清洗干凈,將大豆以水豆比3∶1(mL∶g)在室溫下浸泡12 h；泡好后撈出瀝干,并以水豆比8∶1(mL∶g)進(jìn)行打漿；然后,將過濾后的豆?jié){煮沸(保持沸騰5 min),后將豆?jié){冷卻至80 ℃時(shí)加入CaSO4、GDL及其混合凝固劑,再放入80 ℃水浴鍋保溫30 min。

1.3.3 體外腸胃道消化模型的建立

采用SHIM等[10]的體外胃腸道消化模型進(jìn)行實(shí)驗(yàn),略有改動(dòng)。豆腐與各消化酶溶液的添加比例為豆腐∶唾液淀粉酶溶液∶胃蛋白酶溶液∶胰蛋白酶溶液∶膽液=2.5∶1.0∶1.5∶1.0∶1.0(體積比)。體外消化具體操作方法如下：首先使用玻璃棒將豆腐樣品攪碎,模擬咀嚼過程,取5 g樣品作為未消化樣品,編號(hào)P0。隨后取60 g研磨后的樣品加入24 mL唾液淀粉酶溶液(0.2 mg/mL,溶于20 mmol/L磷酸鹽緩沖液,pH 7.0),在37 ℃恒溫振蕩搖床(轉(zhuǎn)速55 r/min)反應(yīng)3 min,取出7 g樣品作為經(jīng)過唾液消化后的樣品,編號(hào)為P1。再用4 mol/L HCl溶液將體系內(nèi)pH調(diào)至2.0,之后加入33 mL胃蛋白酶溶液(3.2 mg/mL,溶于0.1 mol/L HCl),轉(zhuǎn)速保持不變,胃部消化時(shí)間為1 h,期間分別于第5、60 min吸取10 g樣品,編號(hào)分別為P2-5和P2-60；再用4 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)體系pH至7.0,加入18 mL胰蛋白酶溶液和18 mL膽液(0.4 mg/mL,溶于20 mmol/L 磷酸鹽緩沖液,pH 7.0),于37 ℃,120 r/min條件下繼續(xù)消化2 h后終止消化,期間分別于第30、120 min時(shí)吸取14 g樣品分別編號(hào)為P3-30和P3-120。消化結(jié)束后,各消化階段的樣品均用去離子水定容至14 mL,以確保所有消化階段樣品中的蛋白質(zhì)含量一致,并將定容后的樣品置于沸水浴中5 min,使酶失活。然后吸取2 mL置于離心管中(10 000 r/min,5 min),離心結(jié)束后吸取上清液于收集管中,4 ℃冰箱保存。

1.3.4 可溶性蛋白含量測(cè)定

本實(shí)驗(yàn)采用考馬斯亮藍(lán)法(Bradford法)測(cè)定未消化及消化樣品上清液中可溶性蛋白的含量[11]。1 mL上清液與5 mL考馬斯亮藍(lán)染色液混勻,室溫反應(yīng)5 min后,在可見光分光光度計(jì)上測(cè)定595 nm處的吸光值。可溶性蛋白含量用牛血清白蛋白當(dāng)量表示,以蒸餾水代替樣品反應(yīng),作為空白對(duì)照,牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液(0～100 μg/mL)的線性回歸方程為y=0.008 7x+0.028(R2=0.990 6)。

1.3.5 小肽含量測(cè)定

不同消化階段樣品中的小肽含量測(cè)定參考RUI等[12]的方法進(jìn)行。將2 mL消化樣轉(zhuǎn)移至截留分子質(zhì)量為10 kDa的Millipore超濾管中,在4 ℃、5 000 r/min條件下離心10 min,收集蛋白滲透液。吸取50 μL滲透液與2 mL 反應(yīng)液混勻,室溫下精確反應(yīng)2 min,測(cè)定340 nm處吸光度。小肽含量用胰酪蛋白胨當(dāng)量表示,以蒸餾水代替樣品反應(yīng),作為空白對(duì)照,胰酪蛋白胨標(biāo)準(zhǔn)溶液(0～2.5 mg/mL)的線性回歸方程為y=0.344 9x+0.002 4(R2=0.993 6)。反應(yīng)液的配制如下：25 mL 100 mmol/L 的硼砂、2.5 mL 20%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))SDS、40 mg鄰苯二甲醛(溶解于1 mL甲醇)和100 μL β-巰基乙醇混勻后定容至50 mL。

1.3.6 蛋白質(zhì)水解度的測(cè)定

不同消化階段樣品中蛋白質(zhì)的水解度采用NIELSEN等[13]的方法進(jìn)行檢測(cè)。以絲氨酸制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,以去離子水代替樣品反應(yīng),作為空白對(duì)照。分別取0、100、200、300、400 μL絲氨酸標(biāo)準(zhǔn)液(100 μg/mL)于5 mL試管中,用去離子水補(bǔ)足體積至400 μL,加入3 mL OPA試劑,混勻,精確反應(yīng)2 min后在340 nm處測(cè)定吸光度。利用測(cè)得的吸光度與絲氨酸濃度做標(biāo)準(zhǔn)曲線,其線性回歸方程為y=1.047 2x+0.008(R2=0.996 6)。

口腔-胃-腸各階段消化后的樣品均用去離子水稀釋40倍,吸取400 μL的樣品稀釋液加入3 mL OPA試劑,振蕩混勻,精確反應(yīng)2 min后在340 nm處測(cè)定其吸光度,測(cè)定3次取平均值。OPA試劑的配制：首先將7.62 g四硼酸鈉和200 mg SDS完全溶解于150 mL去離子水中,之后用4 mL乙醇溶解160 mg鄰苯二甲醛并將其轉(zhuǎn)移到上述150 mL溶液中,并用去離子水沖洗,混合后再向溶液中加入176 mg DTT,最后用去離子水定容至200 mL。水解度由公式(1)(2)(3)計(jì)算：

(1)

(2)

(3)

式中：W,每克蛋白質(zhì)中含-NH2的量,mmol/g；C,根據(jù)測(cè)得的吸光度的平均值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算得出,mmol/L；V,樣品消化液的體積,L；N,消化液稀釋倍數(shù)；m,樣品質(zhì)量,g；ω,樣品中蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù),%；h,每克蛋白斷裂的肽鍵毫摩爾數(shù),mmol/g；htot,肽鍵總數(shù)(每克大豆蛋白所含的肽鍵毫摩爾數(shù)為7.8 mmol/g),mmol/g；α、β,分別用常數(shù)1.00、0.40表示。

1.3.7 蛋白質(zhì)消化率測(cè)定

蛋白質(zhì)的消化率是根據(jù)消化10 min后的pH值(X)來計(jì)算的[14],方程如下：消化率Y=210.46-18.10X。每個(gè)樣品均進(jìn)行3次平行試驗(yàn),使用pH計(jì)準(zhǔn)確記錄10 min后pH值的下降情況(樣品初始pH值調(diào)至8.0)。

1.3.8 SDS-PAGE

采用SDS-PAGE對(duì)消化前、口腔、胃、腸不同消化階段樣品中蛋白質(zhì)分子質(zhì)量的變化情況進(jìn)行檢測(cè)。將100 μL上清液與100 μL上樣緩沖液(16 g/L SDS,體積分?jǐn)?shù)12%甘油,體積分?jǐn)?shù)4% β-巰基乙醇,0.25 g/L溴酚藍(lán),20 g/L蔗糖和62.5 mmol/L Tris-HCl,pH 6.8,混勻后定容至100 mL)混合均勻,經(jīng)100 ℃水浴煮沸5 min后,取10 μL上樣。采用12%分離膠和4%濃縮膠進(jìn)行不連續(xù)垂直平板電泳分析。先接通電源,電壓調(diào)至60 V并保持恒壓,當(dāng)樣品進(jìn)入分離膠后調(diào)節(jié)電壓使電壓恒定在120 V,溴酚藍(lán)移動(dòng)離底部約0.5 cm時(shí),切斷電源,停止電泳。使用Quantity One軟件(Version 4.6.2,美國(guó)Bio-Rad公司)進(jìn)行蛋白條帶的數(shù)量及灰度值分析。

1.3.9 數(shù)據(jù)處理與分析

本實(shí)驗(yàn)采用 Microsoft Office 2013 處理數(shù)據(jù),Origin 9.0軟件作圖,采用SPSS 16.0對(duì)各組變量的測(cè)試結(jié)果進(jìn)行顯著性差異分析,顯著性水平P<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 可溶性蛋白含量分析

不同的消化階段豆腐中的可溶性蛋白含量的變化如圖1所示。整體而言,由于各個(gè)消化階段消化酶的存在,空白對(duì)照豆?jié){與3種豆腐的可溶性蛋白含量變化均較為明顯。在消化前(P0階段)可以看到豆?jié){的可溶性蛋白含量最高(8.99 mg/mL),而GDL豆腐、CaSO4豆腐、復(fù)配型豆腐的可溶性含量均較低(0.2 mg/mL左右)且三者無顯著性差異(P>0.05)。由此表明大部分蛋白質(zhì)在豆?jié){中以游離態(tài)存在,而3種豆腐中絕大部分的蛋白質(zhì)保留在豆腐的凝膠基質(zhì)中。這是由于豆?jié){中的大豆蛋白在高溫下分子內(nèi)部疏水基團(tuán)暴露,聚集形成蛋白聚集體,在二價(jià)陽離子Ca2+、H+(GDL水解釋放)等作用下,使蛋白質(zhì)之間的斥力消失從而發(fā)生聚集效應(yīng),形成致密、穩(wěn)定的三維蛋白網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)[15],因此在高速離心時(shí)蛋白保留在豆腐基質(zhì)中沉淀至離心管底部而上清液中含量較少。經(jīng)口腔消化后(P1),3種豆腐的可溶性蛋白含量沒有明顯變化,而豆?jié){中的可溶性蛋白經(jīng)過口腔消化后下降。在接下來的胃消化階段(P2)5 min時(shí),豆?jié){中的可溶性蛋白含量無明顯變化,3種豆腐的可溶性蛋白含量大幅度上升,且存在顯著性差異(P<0.05),CaSO4豆腐的可溶性蛋白含量最高(1.86 mg/mL)。到了胃消化階段(P2)的60 min,在胃蛋白酶的作用下,豆?jié){中的可溶性蛋白含量顯著降低至3.70 mg/mL,同時(shí)GDL豆腐和CaSO4豆腐的可溶性蛋白含量也稍有所下降,而復(fù)配型豆腐的可溶性蛋白含量卻有所升高。而在腸消化階段(P3)的2個(gè)時(shí)間點(diǎn),豆?jié){中的可溶性蛋白含量無明顯變化(3.09～3.12 mg/mL),3組豆腐的可溶性蛋白含量均呈下降趨勢(shì)。究其原因,可能是因?yàn)樵谝鹊鞍酌负湍懸旱淖饔孟?蛋白質(zhì)進(jìn)一步水解成小分子質(zhì)量的多肽和氨基酸,不能被考馬斯亮藍(lán)法測(cè)得,因此實(shí)驗(yàn)結(jié)果呈下降趨勢(shì)。RIOUX等[16]在研究酪蛋白和乳清蛋白比例對(duì)酸奶消化的影響時(shí)也得到了相似的結(jié)果。RUI等[17]研究豆乳經(jīng)乳酸菌發(fā)酵至不同pH值,然后通過體外消化后發(fā)現(xiàn)各樣品在腸消化階段可溶性蛋白含量均低于胃消化階段。另外,胰蛋白酶液及膽鹽溶液的添加起到一定的稀釋作用,且體系中pH的變化以及快速的水解過程均導(dǎo)致了樣品中可溶性蛋白含量的下降。

圖1 體外消化過程中各樣品的可溶性蛋白含量變化圖

Fig.1 Soluble protein contents in different samples during in vitro gastrointestinal simulated digestion

總的來說,體外消化期間豆?jié){和3種豆腐的可溶性蛋白的含量變化主要是因?yàn)榈鞍酌傅乃庾饔?。在GDL、CaSO4和復(fù)配凝固劑制備的大豆蛋白凝膠中,復(fù)配凝固劑的使用顯著提高了大豆蛋白的消化率,從而使更多的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)在胃腸道中釋放,更有利于人體的吸收。

2.2 小肽含量分析

研究指出,具有生物活性的多肽大多數(shù)為分子質(zhì)量較小的肽,尤其是2～10個(gè)氨基酸長(zhǎng)度的短肽[18]。不同消化階段4組樣品中分子質(zhì)量低于10 kDa的小肽含量測(cè)定結(jié)果如圖2所示。整體而言,小肽含量呈上升趨勢(shì)且與可溶性蛋白含量變化相對(duì)應(yīng)。消化前(P0),豆?jié){、GDL豆腐、CaSO4豆腐、復(fù)配型豆腐中小肽含量均較低(0.68～0.80 mg/mL)且彼此間無顯著性差異(P>0.05),表明實(shí)驗(yàn)開始前因?yàn)槲醇酉?大部分大豆蛋白未分解成小肽和氨基酸等物質(zhì)而仍以大分子的形式存在于樣品溶液中。經(jīng)口腔消化后(P1),4組樣品中的小肽含量沒有明顯變化,依然較低,但豆?jié){中的小肽含量最低(0.71 mg/mL)且與其他3種豆腐相比存在顯著性差異(P<0.05)。

圖2 體外消化過程中各樣品中小肽含量變化圖

Fig.2 Peptide contents in different samples during in vitro gastrointestinal simulated digestion

在胃消化末期(P2-60),小肽含量呈略微增加趨勢(shì),豆?jié){與GDL豆腐中的小肽含量差異不顯著但均顯著低于CaSO4豆腐和復(fù)配型豆腐的小肽含量(P<0.05)。因此可以得出,由于胃部諸多因素的影響,CaSO4豆腐、復(fù)配型豆腐較GDL豆腐更適合胃部的消化。在腸消化階段末期(P3-120),在胰蛋白酶和膽液的作用下,蛋白質(zhì)進(jìn)一步水解成小分子質(zhì)量的多肽和氨基酸,導(dǎo)致4組樣品中的小肽含量急劇增加(2.48～3.12 mg/mL)且豆?jié){、GDL豆腐與CaSO4豆腐3組小肽含量無顯著差異(P>0.05),而復(fù)配型豆腐中的小肽含量最高,為3.12 mg/mL。這與該時(shí)期可溶性蛋白含量較低相對(duì)應(yīng),在腸消化時(shí)期釋放大量小肽類營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),而復(fù)配豆腐分解產(chǎn)生的小肽更多,更適合身體吸收營(yíng)養(yǎng)。

2.3 豆腐中大豆蛋白水解度的分析

蛋白質(zhì)水解度DH是指蛋白質(zhì)分子中由于酶法水解而斷裂的肽鍵占蛋白質(zhì)分子中總肽鍵的比例[19]。在消化過程中,大豆蛋白被蛋白酶水解釋放出多種形式的小肽類和游離氨基(—NH2)。蛋白質(zhì)的水解度是通過鄰苯二甲醛法測(cè)定消化期間游離的—NH2釋放量來確定的。在消化的階段中,每水解1個(gè)肽鍵便會(huì)釋放1個(gè)游離的—NH2,游離的—NH2與鄰苯二甲醛反應(yīng)生成一種黃色絡(luò)合物,可用紫外分光光度計(jì)在340 nm處測(cè)定其吸光值。因而,斷裂的肽鍵數(shù)可通過水解后新形成的末端—NH2基團(tuán)的量來確定,通過吸光值來間接得到水解度的大小,吸光值越大水解度也越大。

在不同的消化階段,各豆腐樣品中大豆蛋白水解度的測(cè)定結(jié)果如圖3所示,展示了大豆蛋白4個(gè)消化階段P0、P1、P2-60、P3-120的水解度變化。4組樣品的蛋白質(zhì)水解度整體呈現(xiàn)上升趨勢(shì),而且上升趨勢(shì)較為明顯。在消化前(P0階段),由于沒有加入消化酶,GDL豆腐、CaSO4豆腐、混合復(fù)配豆腐的水解度均較低,由此說明3組豆腐樣品中大豆蛋白均未發(fā)生水解,仍以大分子蛋白質(zhì)的形式存在。在P0階段的可溶性蛋白含量測(cè)定中,豆?jié){的可溶性蛋白含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于GDL豆腐、CaSO4豆腐、復(fù)配型豆腐3組樣品的含量,從而豆?jié){的水解度要相對(duì)大于其他3組樣品的水解度。

在口腔消化階段(P1),3組豆腐樣品的水解度仍較低,說明此時(shí)樣品中大豆蛋白未有明顯水解變化。究其原因可能是由于剛添加唾液淀粉酶進(jìn)行消化的時(shí)間較短(3 min)且唾液淀粉酶水解蛋白的能力很弱,導(dǎo)致3組豆腐樣品的水解度相對(duì)較低。但是在接下來的胃消化階段,在胃消化酶的作用下,3組豆腐樣品的水解度急劇增加。在胃消化末期(P2-60),GDL豆腐水解度為1.02%,CaSO4豆腐的水解度為2.66%,復(fù)配型豆腐的水解度為5.09%,三者具有顯著性差異(P<0.05)。造成這一結(jié)果的原因有很多,主要是由于胃部環(huán)境的因素影響所導(dǎo)致的。胃消化期間的酸性pH消化環(huán)境,胃蛋白酶的存在,不停的機(jī)械振蕩以及足夠的消化時(shí)長(zhǎng)導(dǎo)致各豆腐樣品中蛋白水解度的上升,從而說明此時(shí)蛋白質(zhì)發(fā)生了的水解,生成了各種氨基酸和小肽類物質(zhì),與圖2的小肽含量在胃消化階段結(jié)果相對(duì)應(yīng),胃消化階段在蛋白消化中占據(jù)重要地位。

在腸消化末期(P3-120)階段,3組樣品中的蛋白水解度均大幅度上升,可能是在胰蛋白酶和膽液的作用下,大量的蛋白質(zhì)被進(jìn)一步水解成各種小肽類物質(zhì),使蛋白質(zhì)中的肽鍵大量斷裂,被OPA試劑識(shí)別,因此呈現(xiàn)大幅度上升趨勢(shì)。在3組豆腐樣品中,復(fù)配型豆腐的水解度仍為最高,GDL豆腐與CaSO4豆腐相比,增加幅度要大但是總體仍為后者較高。從圖3可以看出,復(fù)配型豆腐的消化速率要優(yōu)于其他2種豆腐,而CaSO4豆腐的消化特性要略微優(yōu)于GDL豆腐。

圖3 體外消化期間各樣品中蛋白質(zhì)水解度的變化圖

Fig.3 Degree of hydrolysis in different samples during in vitro gastrointestinal simulated digestion.

總的來說,蛋白質(zhì)的快速水解及低分子質(zhì)量多肽數(shù)量的增加是導(dǎo)致水解度持續(xù)升高的原因。從消化前的P0階段到消化后的P3階段的水解度的變化趨勢(shì)發(fā)現(xiàn),消化酶的不同、時(shí)間的不同以及pH的變化都會(huì)對(duì)水解度產(chǎn)生影響。從水解度的結(jié)果來看,樣品蛋白質(zhì)的水解主要發(fā)生在胃消化階段和腸消化階段,其中在腸消化階段蛋白質(zhì)的水解度最高,水解產(chǎn)生的小肽類物質(zhì)較多,胃消化階段略次于腸消化但是高于口腔消化。營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收主要發(fā)生在腸道中,從豆腐樣品以及空白對(duì)照的結(jié)果來看,復(fù)配型豆腐在胃腸道中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)釋放最多,該部分實(shí)驗(yàn)結(jié)論與上述實(shí)驗(yàn)結(jié)論相一致。

2.4 豆腐的體外蛋白消化率分析

表1顯示的是3種豆腐中蛋白質(zhì)的體外消化率測(cè)定結(jié)果,GDL豆腐、CaSO4豆腐及復(fù)配型豆腐中蛋白消化率分別為：(81.70±0.14)%、(80.70±0.28)%、(81.65±0.35)%。該結(jié)果表明3種豆腐的體外蛋白質(zhì)消化率相差不大,相對(duì)而言,GDL豆腐和復(fù)配型豆腐的蛋白質(zhì)消化率無顯著性差異,但均高于CaSO4豆腐(P<0.05)。

表1 三種凝固劑制備的豆腐的體外蛋白消化率

Table 1 In vitro digestibility of three kinds of tofu with different coagulant

注：不同小寫字母表示在0.05 水平上存在顯著性差異

2.5 SDS-PAGE電泳分析

通過SDS-PAGE測(cè)定每個(gè)樣品的蛋白質(zhì)圖譜,結(jié)果如圖4所示。眾所周知,β-伴大豆球蛋白(7S)和大豆球蛋白(11S)是大豆蛋白中最主要的2種蛋白。β-伴大豆球蛋白由3種亞基構(gòu)成(α′,α,β),大豆球蛋白是一種由二硫鍵連接酸性亞基和堿性亞基而組成的六聚體蛋白質(zhì)[20]。P0階段收集的豆?jié){中包含數(shù)條分子質(zhì)量在20～100 kDa之間的條帶,用數(shù)字1～6來指示(圖4-a),其分子質(zhì)量分別為81.00、73.89、47.89、37.88、36.54和20.42 kDa。根據(jù)先前的研究,推測(cè)它們分別對(duì)應(yīng)于7S球蛋白α′亞基(條帶1),7S球蛋白α亞基(條帶2),7S球蛋白β亞基(條帶3),11S A3亞基(條帶4)、11S酸性亞基(條帶5)、11S堿性亞基(條帶6)[21]。

從圖4可以看出,各豆腐樣品在消化前(P0)蛋白條帶較少,包括5個(gè)主要的條帶(編號(hào)7～11),其相應(yīng)的分子質(zhì)量(kDa)分別為83.67(條帶7)、58.22(條帶8)、41.49(條帶9)、25.60(條帶10)、17.52(條帶11),這與該階段豆腐樣品中測(cè)得較低的可溶性蛋白含量相一致。其中7S球蛋白α′亞基、11S酸性亞基在所研究的豆腐樣品可溶性蛋白組分中均不存在,缺失的蛋白質(zhì)條帶可能分布在相應(yīng)的豆腐基質(zhì)中。而條帶7、條帶9以及條帶11可能與7S球蛋白α亞基、11S A3亞基以及11S堿性亞基相關(guān),這分別基于它們和條帶1、條帶4和條帶6相似的分子質(zhì)量。經(jīng)過口腔消化后(P1),蛋白條帶并未增加,這是因?yàn)橥僖褐胁缓械鞍酌?不能使蛋白發(fā)生水解。而在胃蛋白酶的作用下(P2),各豆腐凝膠中的蛋白質(zhì)得到釋放,出現(xiàn)了相似的蛋白質(zhì)圖譜,形成分子質(zhì)量在15～35 kDa內(nèi)的諸多蛋白條帶(此范圍內(nèi)條帶編號(hào)12～16)。

P0-消化前；P1-口腔消化后；P2-5,P2-60指胃消化的第5,60 min(P2階段)；P3-30,P3-120指腸消化的第30,120 min(P3階段)

圖4 各樣品消化期間的蛋白電泳圖譜

Fig.4 SDS-PAGE analysis of digested samples before the in vitro digestion

經(jīng)過胃消化階段后(P2-60)樣品組CaSO4豆腐和GDL豆腐所出現(xiàn)的4個(gè)條帶分子質(zhì)量大致相同。在隨后的P3階段,各條帶的光密度值以及數(shù)量逐漸減弱,蛋白濃度逐漸降低。而復(fù)配型豆腐中僅出現(xiàn)了2條帶(條帶13、條帶14),沒有觀察到額外的完整條帶,其灰度值明顯低于空白對(duì)照組。隨著腸消化階段的進(jìn)行,幾乎無法觀測(cè)出清晰的條帶。

從條帶亮度結(jié)果分析可知,空白組豆?jié){的蛋白質(zhì)條帶亮度最大,表明蛋白含量最高,這一結(jié)果與可溶性蛋白含量分析的結(jié)果相一致。綜合實(shí)驗(yàn)可以發(fā)現(xiàn)4種樣品的蛋白降解情況相似,但復(fù)配型豆腐中蛋白質(zhì)的降解速率最快。隨著消化過程的進(jìn)行,各樣品中可觀察到的條帶越來越模糊,消化效果進(jìn)一步提升,可以得到可溶性蛋白含量進(jìn)一步減少,小肽含量和水解度得到增加,這與上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果相對(duì)應(yīng)。

3 結(jié)論

在本研究中,使用CaSO4、GDL以及兩者復(fù)配的混合型凝固劑制備豆腐,通過模擬體外消化實(shí)驗(yàn)來探究不同凝固劑對(duì)豆腐中大豆蛋白消化率的影響。通過可溶性蛋白含量、小肽含量、水解度、體外蛋白消化率、SDS-PAGE的測(cè)定結(jié)果綜合分析得出,體外消化的主要階段在胃-腸道消化時(shí)期,此時(shí)期可溶性蛋白含量呈先上升后下降的趨勢(shì),表明在此期間可溶性蛋白被大量釋放然后消化吸收。在小肽含量測(cè)試和水解度分析中,在胃消化階段的末期到腸消化階段為體外消化變化的峰值,此時(shí)的大豆蛋白水解度最高,小肽類物質(zhì)被大量釋放。體外蛋白消化率的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明復(fù)配型凝固劑制備的豆腐其蛋白消化率要高于其他2組樣品豆腐,而添加CaSO4作凝固劑的豆腐體外消化率低于GDL豆腐,二者差異顯著且風(fēng)味有所不同。通過SDS-PAGE圖譜得出,3種豆腐樣品胃腸道消化期間蛋白降解情況相似,但復(fù)配型豆腐中蛋白質(zhì)的降解速率最快。綜合上述,復(fù)配凝固劑制作豆腐更利于大豆蛋白的消化吸收。