蛹蟲草發(fā)酵產(chǎn)蟲草素工藝優(yōu)化

蟲草素(cordycepin)又稱蟲草菌素,是一種腺苷類物質(zhì),別稱3′-脫氧腺苷[1]。蟲草素是蛹蟲草的主要有效成分,具有抗腫瘤、抗炎癥、抗輻射、抗氧化、降血壓、抗衰老、提高免疫力和改善記憶等功能[2-5]。蟲草素制備方法主要有生物發(fā)酵法和化學(xué)合成法?；瘜W(xué)合成主要以腺苷或其衍生物為原料合成3′-脫氧核糖環(huán)鹵代物,最后加氫脫鹵制取。合成過程復(fù)雜反應(yīng)苛刻、成本高、產(chǎn)率低,且反應(yīng)過程中產(chǎn)生大量有機(jī)廢液對(duì)環(huán)境造成不良影響,因此難以工業(yè)化生產(chǎn)[6]。發(fā)酵法是由蛹蟲草液體或者固態(tài)培養(yǎng),并經(jīng)過膜分離及樹脂純化獲得。固態(tài)培養(yǎng)生產(chǎn)周期長(zhǎng)(50～60 d)、不易控制、產(chǎn)量低、勞動(dòng)量大,不能滿足工業(yè)原料需求。液體發(fā)酵生產(chǎn)周期短(15～25 d)、易于控制、產(chǎn)量高、應(yīng)用潛力大[7-9]。

目前關(guān)于蟲草素液體發(fā)酵的研究主要集中于育種和培養(yǎng)基優(yōu)化。張楠等[10]以蛹蟲草NS-810為菌種,通過單次單因素試驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn),優(yōu)化深層發(fā)酵產(chǎn)蟲草素的最佳培養(yǎng)基,其配方為葡萄糖、土豆、魚蛋白胨、(NH4)2SO4、KH2PO4、MgSO4、蠶蛹粉、維生素B1,優(yōu)化后蟲草素的總產(chǎn)量為1.14 g/L,較基礎(chǔ)培養(yǎng)基提高了1.46倍。鄭威等[11]在基礎(chǔ)培養(yǎng)基為小米、葡萄糖、白糖、KH2PO4、MgSO4、蛋白胨、酵母浸膏、氨基酸條件下,分析了不同培養(yǎng)條件對(duì)蟲草素合成的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)擬青霉在溫度21 ℃、38 h、維生素B1添加量0.08 g/L 時(shí),擬青霉A20140822 發(fā)酵生產(chǎn)蟲草素質(zhì)量濃度最高達(dá)到1.465 g/L,比對(duì)照提高20%以上。MASUDA等[12]研究添加腺苷和腺嘌呤等對(duì)蛹蟲草NBRC9787產(chǎn)蟲草素發(fā)酵的影響,與對(duì)照組相比,蟲草素濃度提高了15%。SHIH等[13]通過對(duì)蟲草素生產(chǎn)工藝的優(yōu)化設(shè)計(jì),確定了生產(chǎn)蟲草素的最佳工藝條件即在pH 6、酵母膏質(zhì)量濃度為45 g/L,振蕩培養(yǎng)8 d、靜態(tài)培養(yǎng)16 d,蟲草素的最大產(chǎn)量為2.2 g/L,明顯高于未優(yōu)化前的靜態(tài)培養(yǎng)發(fā)酵水平。DAS等[14]利用突變體G81-3為發(fā)酵菌株,采用中心復(fù)合設(shè)計(jì)的響應(yīng)面分析,得到最佳碳源為葡萄糖,質(zhì)量濃度86.2 g/L,氮源為酵母提取物,質(zhì)量濃度93.8 g/L,蟲草素產(chǎn)量為6.84 g/L,是對(duì)照的2.79倍。雖然關(guān)于培養(yǎng)基優(yōu)化的研究很多,但多局限于培養(yǎng)基的設(shè)計(jì)層面。對(duì)深層發(fā)酵和規(guī)模放大工藝少有研究。本論文在前期研究基礎(chǔ)上[15]進(jìn)一步探討工藝放大可行性,為工業(yè)化應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 供試菌株

Cordyceps militaris CGMCC 18581由CICC14014誘變所得,現(xiàn)保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心。

1.1.2 試劑

甲醇、葡萄糖、MgSO4、KH2PO4、K2HPO4、NaCl,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；蛋白胨(食品級(jí)),河南信和生物科技有限公司；酵母粉,安琪酵母股份有限公司；腺嘌呤、蟲草素,上海生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

固體培養(yǎng)基(g/L)：土豆汁200,復(fù)配葡萄糖20,MgSO41,瓊脂20,pH不調(diào)控。

種子培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖28,酵母膏15,蛋白胨20,KH2PO40.5,K2HPO420.5,MgSO41,用稀鹽酸調(diào)pH至5.8。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖28,酵母膏15,蛋白胨20,KH2PO40.5,K2HPO420.5,MgSO41,吐溫-80 0.5,腺嘌呤4,用稀鹽酸調(diào)pH至5.8。

1.2 儀器與設(shè)備

1260高效液相色譜,安捷倫科技(中國)有限公司；752 N分光光度計(jì),上海儀電有限公司；XSP10顯微鏡,萬衡儀器有限公司；SX-700立式全自動(dòng)滅菌鍋,TOMY公司；ZQZY-CF振蕩培養(yǎng)箱,上海知楚儀器有限公司；SW-CJ-1BU超凈工作臺(tái),蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；定制多層反應(yīng)器,迪必爾生物工程(上海)有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 培養(yǎng)基

菌株平板活化：將保藏的蛹蟲草菌株轉(zhuǎn)接至固體培養(yǎng)基,26 ℃培養(yǎng)6 d。

搖瓶種子培養(yǎng)：搖瓶培養(yǎng)作為一級(jí)種子培養(yǎng)(擴(kuò)培次數(shù)定義為0),500 mL三角瓶裝液量100 mL,121 ℃滅菌后降至常溫保壓。將平板菌絲體刮入搖瓶中。180 r/min、26 ℃培養(yǎng)2～3 d。

發(fā)酵罐種子培養(yǎng)：10 L攪拌罐培養(yǎng)作為2級(jí)種子培養(yǎng)(擴(kuò)培次數(shù)定義為1,后續(xù)擴(kuò)培均在10 L玻璃罐基礎(chǔ)上進(jìn)行擴(kuò)培),裝液量50%,121 ℃滅菌后降至常溫保壓。將搖瓶菌種通過火焰圈接種至種子罐。120～400 r/min、通氣量6～10 L/h、26 ℃培養(yǎng)48～120 h。

搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)：種子罐接有空消過的空補(bǔ)料瓶,通過壓差將培養(yǎng)好的種子壓入空瓶中,并在超凈臺(tái)中,按10%接種量接種至裝有發(fā)酵培養(yǎng)基三角搖瓶中,26 ℃下靜置發(fā)酵25 d。

發(fā)酵罐(多層反應(yīng)器)發(fā)酵：按15%接種量接入裝有35 L無菌發(fā)酵培養(yǎng)基的50 L發(fā)酵罐,混合后,通過壓差和溢液方式裝滿無菌多層反應(yīng)器,26 ℃、通氣量1 000 L/h、壓力0.07 MPa條件下發(fā)酵25 d。

1.3.2 分析方法

蟲草素檢測(cè)：取發(fā)酵液離心后上清液稀釋20倍,0.22 μm濾膜過濾,得到待測(cè)樣品液。采用液相色譜法測(cè)定蟲草素含量。色譜條件：色譜柱Sepax HP-C18；檢測(cè)器：紫外;波長(zhǎng)254 nm；柱溫30 ℃；流動(dòng)相：甲醇∶KH2PO4(1.36 g/L)=25∶75；流速0.8 mL/min；進(jìn)樣量20 μL。以外標(biāo)峰面積法進(jìn)行定量分析。

生物量測(cè)定：發(fā)酵液離心后,用純水洗滌3次,最終離心沉淀物置于80 ℃烘箱干燥至恒重,沉淀物干重與發(fā)酵液比值定為生物量濃度。

菌體形態(tài)檢測(cè)：通過顯微鏡觀察,物鏡40倍。

底物轉(zhuǎn)化率P按公式(1)計(jì)算：

(1)

式中：Cc,蟲草素質(zhì)量濃度,mg/mL；Ca,腺嘌呤質(zhì)量濃度,mg/mL；Vi,發(fā)酵初體積,mL；Vt,發(fā)酵終體積,mL；1.86,理論轉(zhuǎn)化率,即1 g腺嘌呤理論產(chǎn)1.86 g的蟲草素。

采用Origin 8.1進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析及作圖,蟲草素合成曲線用公式(2)所示數(shù)學(xué)模型：

(2)

式中:y,蟲草素質(zhì)量濃度,g/L;x,發(fā)酵時(shí)間,d;A1、A2和p為擬合常數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 種子質(zhì)量對(duì)發(fā)酵的影響

2.1.1 轉(zhuǎn)速影響

在維持溶氧不低于30%基礎(chǔ)上,分別分析了不同轉(zhuǎn)速對(duì)種子培養(yǎng)的影響。在較低轉(zhuǎn)速下,菌絲生長(zhǎng)速率相對(duì)較慢,直至發(fā)酵終點(diǎn),菌體一直呈上升趨勢(shì)(圖1)。隨著轉(zhuǎn)速提高,前期菌體生長(zhǎng)速率明顯提升,在高轉(zhuǎn)速下(400 r/min),培養(yǎng)3 d菌體量可以達(dá)到16 g/L以上,但發(fā)酵后期有菌體量下降趨勢(shì)。

圖1 不同轉(zhuǎn)速對(duì)菌種生長(zhǎng)的影響

Fig.1 Influence of different rotation speeds on the growth of strains

從圖2-a可知,低轉(zhuǎn)速下,菌絲體形態(tài)較為完整,高轉(zhuǎn)速下出現(xiàn)自溶現(xiàn)象(圖2-c)。鐘思敏等[16]報(bào)道,在蛹蟲草深層動(dòng)態(tài)培養(yǎng)時(shí),轉(zhuǎn)速對(duì)菌體生長(zhǎng)形態(tài)和產(chǎn)物轉(zhuǎn)化等有顯著影響,并發(fā)現(xiàn)最適轉(zhuǎn)速為180 r/min,即低轉(zhuǎn)速對(duì)發(fā)酵有利。

a-120 r/min；b-250 r/min；c-400 r/min

圖2 不同轉(zhuǎn)速下培養(yǎng)5 d的菌絲體形態(tài)

Fig.2 Morphology of mycelium cultured at different rotating speeds for 5 days

不同轉(zhuǎn)速和培養(yǎng)時(shí)間下的菌種對(duì)蟲草素發(fā)酵影響也較為明顯,如圖3所示,在低轉(zhuǎn)速下,菌種生長(zhǎng)周期長(zhǎng),培養(yǎng)5 d的菌種質(zhì)量較佳。而在高轉(zhuǎn)速下,培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng),菌種活性有明顯下降,對(duì)蟲草素合成有顯著影響。因此選擇轉(zhuǎn)速250 r/min,培養(yǎng)周期3 d為宜,此時(shí)菌體質(zhì)量濃度為14 g/L左右。

圖3 不同培養(yǎng)條件對(duì)蟲草素合成影響

Fig.3 Effects of different culture conditions on the synthesis of cordycepin

2.1.2 接種量影響

如表1所示,接種量小(5%),菌體生物量濃度偏低,即生長(zhǎng)速率慢,從而導(dǎo)致蟲草素濃度較低。提高接種量,生物量有明顯提高。當(dāng)接種量15%時(shí),蟲草素質(zhì)量濃度達(dá)最高值6.03 g/L。

表1 不同接種量對(duì)發(fā)酵的影響

Table 1 Effects of different inoculation doses on fermentation

房天琪[17]的研究也得到類似的結(jié)果,接種量為15%～20%時(shí)蟲草素濃度相對(duì)較高；當(dāng)接種量提高至25%時(shí),生物量最高達(dá)到22 g/L以上,但蟲草素有明顯下降。這可能由于底物往菌體生長(zhǎng)途徑轉(zhuǎn)化。

2.1.3 種子擴(kuò)培級(jí)數(shù)影響

由于考慮到后期工藝放大情況,考察了菌種擴(kuò)培次數(shù)對(duì)菌種質(zhì)量的影響。以搖瓶培養(yǎng)定為擴(kuò)培0次,10 L種子罐培養(yǎng)定為擴(kuò)培1級(jí),將種子罐培養(yǎng)的種子轉(zhuǎn)接至另外10 L種子罐培養(yǎng)定為2級(jí),以此類推。每級(jí)種子培養(yǎng)終指標(biāo)為生物量14 g/L左右。從圖4發(fā)現(xiàn),菌種擴(kuò)培2級(jí)后,種子質(zhì)量對(duì)蟲草素合成有明顯影響,尤其在種子擴(kuò)培4級(jí)時(shí),蟲草素濃度下降顯著,這可能與菌種在多次傳代后出現(xiàn)退化有關(guān)。所以在工藝放大應(yīng)用時(shí),菌種擴(kuò)培次數(shù)盡量不超過2次。

圖4 不同擴(kuò)培級(jí)數(shù)對(duì)蟲草素發(fā)酵影響

Fig.4 Effects of different propagation times on cordycepin fermentation

2.2 裝液高徑比對(duì)發(fā)酵影響

以高徑比2 cm/15 cm作為對(duì)照組,高徑比較大(2 cm/5 cm)時(shí),蟲草素濃度及底物轉(zhuǎn)化率顯著降低。高徑比較小(2 cm/30 cm)時(shí),蟲草素產(chǎn)量較高,但轉(zhuǎn)化率沒有提升。這主要由于表面積較大時(shí),水分揮發(fā)嚴(yán)重,對(duì)中后期菌體生長(zhǎng)有一定的副作用。另外,在高徑比相似時(shí),液面高度越大,對(duì)蟲草素合成影響也越大,尤其當(dāng)高度>4 cm時(shí),蟲草素和轉(zhuǎn)化率都有明顯下降。結(jié)果說明蟲草素發(fā)酵需要較為合適的裝液高徑比,且裝液高度對(duì)其發(fā)酵影響更大。研究表明,過多的裝液量會(huì)導(dǎo)致溶解氧缺乏,不利于菌絲生長(zhǎng)和代謝產(chǎn)物合成[18-19]。然而比表面積過大,也不利于蟲草素發(fā)酵,除了揮發(fā)作用大,其對(duì)菌體生長(zhǎng)影響也較明顯。SUPARMIN等[20]通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析深層液體發(fā)酵和淺層液體發(fā)酵體系的基因表達(dá),發(fā)現(xiàn)低溶氧下的淺層液體發(fā)酵更有利于蟲草素積累。

表2 不同高徑比對(duì)蟲草素發(fā)酵影響

Table 2 Effects of different height/diameter ratios on cordycepin fermentation

2.3 120 L多層反應(yīng)器驗(yàn)證

采用以上最佳高徑比的尺寸設(shè)計(jì)了120 L(實(shí)際裝液量40 L)多層反應(yīng)器,如圖5所示,內(nèi)部為淺層托盤,直徑40 cm,裝液高度2.7 cm,托盤數(shù)量12個(gè)。

圖5 120 L多層反應(yīng)器

Fig.5 120 L multilayer reactor

接種發(fā)酵25 d結(jié)果如圖6所示。該曲線采用常規(guī)生長(zhǎng)曲線模型進(jìn)行擬合,決定系數(shù)R2值為0.985。發(fā)酵5 d,幾乎沒有產(chǎn)量,發(fā)酵第5～15天蟲草素合成速率明顯提高,尤其在發(fā)酵第15～20天時(shí),蟲草素合成速率顯著提高,之后增長(zhǎng)速率稍有下降。這主要受生物量合成的影響,即前期菌體生長(zhǎng)緩慢,菌體達(dá)到穩(wěn)定期后,產(chǎn)物合成速率明顯提高。

圖6 蟲草素產(chǎn)量隨培養(yǎng)時(shí)間的變化

Fig.6 Variation of cordycepin concentration with culture time

發(fā)酵25 d后,發(fā)酵終體積31.5 L,蟲草素質(zhì)量為167.58 g,轉(zhuǎn)化率57.0%。轉(zhuǎn)化率稍低于小試結(jié)果(裝液高徑比2 cm/30 cm)。這可能與罐內(nèi)氣體管路設(shè)計(jì)不科學(xué)有關(guān),使得氣體分布效果不理想,從而影響發(fā)酵效果。

3 結(jié)論與討論

本文首先以發(fā)酵生物量和蟲草素產(chǎn)量為指標(biāo)評(píng)估了菌種質(zhì)量。通過對(duì)轉(zhuǎn)速、接種量和擴(kuò)培級(jí)數(shù)等進(jìn)行優(yōu)化分析,獲得了最佳條件為：轉(zhuǎn)速250 r/min,接種量15%,擴(kuò)培級(jí)數(shù)1～2次。此條件下的蟲草素發(fā)酵產(chǎn)量可達(dá)6 g/L左右。其次分析了不同裝液量的高徑比對(duì)蟲草素發(fā)酵的影響,發(fā)現(xiàn)2 cm/30 cm為最適高徑比,以上述最佳條件為依據(jù),進(jìn)行了120 L多層反應(yīng)器發(fā)酵工藝驗(yàn)證。結(jié)果顯示：發(fā)酵25 d,蟲草素產(chǎn)量為5.32 g/L,轉(zhuǎn)化率為57%,與小試工藝結(jié)果較為一致。本實(shí)驗(yàn)證明了工藝放大的可行性,為進(jìn)一步工業(yè)化應(yīng)用提供了參考