重組限制性內(nèi)切酶Pst I發(fā)酵條件優(yōu)化

限制性內(nèi)切酶(簡(jiǎn)稱為“限制酶”)是一大類能夠特異性識(shí)別與切割 DNA 分子內(nèi)特定序列的核酸內(nèi)切酶,被稱作“基因的剪刀”、“分子手術(shù)刀”等[1-4],被廣泛應(yīng)用于DNA重組、基因定位與克隆、核酸疫苗制備等生物醫(yī)藥的各個(gè)領(lǐng)域[5-7]。

限制性內(nèi)切酶來(lái)源于原核生物的“限制-修飾”系統(tǒng),原始宿主自身的DNA被自身限制酶對(duì)應(yīng)的甲基化酶修飾,從而避免被自身所產(chǎn)生的限制酶切割[8]。但常用的蛋白質(zhì)工程菌宿主DNA不具備相應(yīng)的甲基化修飾,直接重組表達(dá)限制酶會(huì)導(dǎo)致宿主因DNA被切割而死亡。因此,限制酶的大規(guī)模生產(chǎn)一直是世界性的難題,自20世紀(jì)70年代第一個(gè)限制性內(nèi)切酶產(chǎn)品上市以來(lái)的40多年里,全球限制性內(nèi)切酶市場(chǎng)幾乎一直被美國(guó)NEB、美國(guó)Thermo Fisher、日本TaKaRa等幾家企業(yè)壟斷。

本實(shí)驗(yàn)室在前期研究中,利用廣譜甲基化保護(hù)策略,實(shí)現(xiàn)了多種限制性內(nèi)切酶的重組表達(dá)[8-9],成果初步實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化,性能不亞于國(guó)外同類產(chǎn)品。但企業(yè)現(xiàn)有生產(chǎn)工藝仍停留在低密度搖瓶培養(yǎng)的階段,產(chǎn)量低,成本高,無(wú)法滿足行業(yè)需求。而將搖瓶發(fā)酵工藝參數(shù)直接移植到發(fā)酵罐之后,幾乎所有的限制酶均出現(xiàn)了產(chǎn)率下降的現(xiàn)象,少數(shù)種類甚至無(wú)法成功表達(dá)。因此,開(kāi)發(fā)限制酶的高密度發(fā)酵工藝,是實(shí)現(xiàn)限制性內(nèi)切酶國(guó)產(chǎn)化的必經(jīng)之路。

限制性內(nèi)切酶Pst I是1976年從斯氏普羅威登斯菌(Providencia stuartii)中分離出來(lái)的一種II型限制性內(nèi)切酶,是最常用的30種限制酶之一[10]。本研究以Pst I為代表,使用大腸桿菌作為重組表達(dá)宿主,對(duì)影響菌體量與酶產(chǎn)率的發(fā)酵條件進(jìn)行了篩選,優(yōu)化了Pst I的重組表達(dá)發(fā)酵條件,同時(shí)也為實(shí)現(xiàn)其他限制性內(nèi)切酶的大規(guī)模生產(chǎn)提供了參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

Pst I大腸桿菌重組表達(dá)菌株,本實(shí)驗(yàn)室自行制備保存；商品lightingTMPst I酶、CutOneTM反應(yīng)緩沖液、無(wú)縫克隆試劑盒,江蘇愚公生命科技有限公司；Ni 親和層析基質(zhì)(Toyopearl AF),東曹(上海)生物科技有限公司；HiTrap Heparin親和層析柱,美國(guó)GE公司；Lambda DNA與B-PER細(xì)胞裂解液,美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；其他未注明試劑均為分析純,中國(guó)國(guó)藥控股有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

恒溫金屬浴,杭州米歐儀器有限公司；恒溫震蕩搖床,上海一恒科技有限公司；GenoSens1860凝膠成像系統(tǒng),上海勤翔科學(xué)儀器有限公司；JN-02細(xì)胞高壓破碎儀,廣州聚能生物科技有限公司；Avanti J-26 s XP 高速冷凍離心機(jī),美國(guó)Beckman公司；高速冷凍離心機(jī),德國(guó)Eppendorf公司；Synteny Neo2多功能酶標(biāo)儀,美國(guó)Bio Tek公司；T100梯度PCR儀,美國(guó)Bio-Rad公司；六聯(lián)排玻璃發(fā)酵罐(1 L×6),上海百侖生物科技有限公司；NanoDrop Lite 分光光度計(jì),美國(guó)Thermo Scientific公司。

1.3 Pst I 發(fā)酵條件優(yōu)化

1.3.1 優(yōu)化發(fā)酵溫度

取本實(shí)驗(yàn)室保藏的Pst I大腸桿菌重組表達(dá)菌株在含有0.1 g/L卡那霉素和0.15 g/L氯霉素的LB平板培養(yǎng)基上劃線,37 ℃培養(yǎng)活化。挑取陽(yáng)性單克隆,測(cè)序驗(yàn)證后接種于10 ml LB液體培養(yǎng)基中,37 ℃,200 r/min過(guò)夜培養(yǎng),獲得發(fā)酵種子液。然后以5%(體積分?jǐn)?shù),下同)的接種量接種于含有0.1 g/L卡那霉素與0.15 g/L氯霉素的2YT液體培養(yǎng)基中,于六聯(lián)排玻璃發(fā)酵罐中400 r/min進(jìn)行發(fā)酵。當(dāng)發(fā)酵液OD600到達(dá)0.8時(shí),使用終濃度0.5 mmol/L 的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo),分別設(shè)置發(fā)酵溫度為37、30、23與16 ℃,發(fā)酵12 h。

1.3.2 優(yōu)化誘導(dǎo)后發(fā)酵時(shí)間

將種子液以5%的接種量接種于含有0.1 g/L卡那霉素與0.15 g/L氯霉素的2YT液體培養(yǎng)基中,于六聯(lián)排玻璃發(fā)酵罐中發(fā)酵。當(dāng)發(fā)酵液OD600到達(dá)0.8時(shí),使用終濃度0.5 mmol/L 的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo),同時(shí)分別設(shè)置誘導(dǎo)后發(fā)酵時(shí)間為2、4、6、8、10、12、14、16與18 h。

1.3.3 優(yōu)化誘導(dǎo)劑濃度

將種子液以5%的接種量接種于含有0.1 g/L卡那霉素與0.15 g/L氯霉素的2YT液體培養(yǎng)基中,于六聯(lián)排玻璃發(fā)酵罐中發(fā)酵。當(dāng)發(fā)酵液OD600到達(dá)0.8時(shí),使用終濃度分別為0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8與2.0 mmol/L的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)。

1.3.4 優(yōu)化補(bǔ)充碳源

將種子液以5%的接種量接種于含有0.1 g/L卡那霉素與0.15 g/L氯霉素的2YT液體培養(yǎng)基中,同時(shí)分別添加10 g/L的葡萄糖、甘油、蔗糖與麥芽糖作為補(bǔ)充碳源,于六聯(lián)排玻璃發(fā)酵罐中發(fā)酵。當(dāng)發(fā)酵液OD600到達(dá)0.8時(shí),使用IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)。

1.3.5 優(yōu)化pH值

將種子液以5%的接種量分別接種于含有0.1 g/L卡那霉素與0.15 g/L氯霉素的2YT液體培養(yǎng)基中,于六聯(lián)排玻璃發(fā)酵罐進(jìn)行發(fā)酵。在發(fā)酵開(kāi)始前使用10%氨水 與10%磷酸(均為體積分?jǐn)?shù),下同)分別調(diào)整發(fā)酵體系pH值為5.0、6.0、7.0、8.0與9.0(±0.2)。當(dāng)發(fā)酵液OD600到達(dá)0.8時(shí),使用IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)。

1.3.6 優(yōu)化誘導(dǎo)時(shí)機(jī)

將種子液以5%的接種量分別接種于含有0.1 g/L卡那霉素與0.15 g/L氯霉素的2YT液體培養(yǎng)基中于六聯(lián)排玻璃發(fā)酵罐進(jìn)行發(fā)酵。然后于每2 h測(cè)定發(fā)酵液OD600,繪制菌體生長(zhǎng)曲線。

將種子液以5%的接種量分別接種于含有0.1 g/L卡那霉素與0.15 g/L氯霉素的2YT液體培養(yǎng)基中于六聯(lián)排玻璃發(fā)酵罐進(jìn)行發(fā)酵。在發(fā)酵開(kāi)始時(shí)使用10%氨水與10%磷酸調(diào)整發(fā)酵體系pH值,當(dāng)發(fā)酵進(jìn)行到2、4、6與8 h時(shí)使用IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)。

1.4 Pst I 酶活力檢測(cè)

本研究中Pst I酶活力采用如下定義：37 ℃下,在10 μl反應(yīng)體系中,能夠在15 min內(nèi)完全消化1 μg Lambda DNA所需的酶量定義為1 U。發(fā)酵結(jié)束后取1 ml發(fā)酵液5 500 r/min,5 min離心分離菌體與上清液。將菌體控干水分置于-20 ℃下,加入100 μl B-PER細(xì)胞裂解液裂解菌體4 ℃,13 000×g,20 min離心獲得粗酶液。取20 μl粗酶液,以2倍梯度稀釋。酶活力測(cè)試反應(yīng)體系為10 μl,包括1 μl稀釋酶液,1 μg Lambda DNA以及1 μl 10× CutOne緩沖液,將其置于恒溫金屬浴中37 ℃ 孵育15 min,然后將其移至已預(yù)熱至80 ℃的恒溫金屬浴中失活20 min,使用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)酶切產(chǎn)物。第1個(gè)無(wú)法完全消化Lambda DNA底物的稀釋梯度所對(duì)應(yīng)的上一級(jí)稀釋液酶濃度即為1 U/μl。

1.5 Pst I 蛋白純化

將種子液以5%的接種量分別接種于含有0.1 g/L卡那霉素與0.15 g/L氯霉素的2YT液體培養(yǎng)基中于發(fā)酵罐進(jìn)行發(fā)酵。在發(fā)酵開(kāi)始時(shí)使用10%氨水與10%磷酸調(diào)整發(fā)酵體系pH值,使用IPTG進(jìn)行誘導(dǎo),待發(fā)酵結(jié)束后,破碎細(xì)胞并依次使用Ni親和層析柱與肝素親和層析柱對(duì)Pst I蛋白進(jìn)行純化,使用SDS-PAGE檢測(cè)純化后蛋白,同時(shí)使用NanoDrop Lite 分光光度計(jì)對(duì)蛋白濃度進(jìn)行測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵條件優(yōu)化

2.1.1 優(yōu)化發(fā)酵溫度

溫度是影響菌體生長(zhǎng)代謝、重組產(chǎn)物形成與質(zhì)粒穩(wěn)定性的重要因素。大腸桿菌最適生長(zhǎng)溫度為37 ℃,最高生長(zhǎng)溫度為41.6 ℃,最低生長(zhǎng)溫度為8.46 ℃[11],因此為獲得高水平Pst I蛋白表達(dá),需對(duì)發(fā)酵溫度進(jìn)行優(yōu)化。隨著誘導(dǎo)溫度增加,酶產(chǎn)率呈不斷增加趨勢(shì)；當(dāng)發(fā)酵溫度為37 ℃時(shí),酶產(chǎn)率菌體量最高(圖1)?？赡苁且?yàn)?7 ℃ 時(shí)菌體生長(zhǎng)速度、蛋白的表達(dá)速度與相關(guān)酶活性高,有利于Pst I蛋白積累。

圖1 發(fā)酵溫度對(duì)菌體生長(zhǎng)及酶產(chǎn)率的影響

Fig.1 Effect of culture temperatures on the growth of engineering bacteria and Pst I production

2.1.2 優(yōu)化誘導(dǎo)后發(fā)酵時(shí)間

誘導(dǎo)后發(fā)酵時(shí)間是影響外源基因重組表達(dá)的重要因素[12],尤其對(duì)于限制性內(nèi)切酶而言,發(fā)酵時(shí)間過(guò)短則蛋白表達(dá)量不夠,發(fā)酵時(shí)間過(guò)長(zhǎng)則有可能積累細(xì)胞毒性導(dǎo)致宿主細(xì)胞死亡。如圖2所示,隨誘導(dǎo)后發(fā)酵時(shí)間的增加,Pst I酶產(chǎn)率表現(xiàn)出先增加后降低的趨勢(shì),同時(shí)菌體量隨發(fā)酵時(shí)間的增加而不斷增加,因此Pst I菌株最佳誘導(dǎo)后發(fā)酵時(shí)間為8 h時(shí)。

圖2 誘導(dǎo)后發(fā)酵時(shí)間對(duì)菌體生長(zhǎng)及酶產(chǎn)率的影響

Fig.2 Effect of post-induction fermentation times on the growth of engineering bacteria and Pst I production

2.1.3 優(yōu)化IPTG誘導(dǎo)濃度

本研究所使用的重組表達(dá)載體是在pET28b基礎(chǔ)上構(gòu)建的,具有乳糖操縱子調(diào)控的啟動(dòng)子,可使用乳糖類似物IPTG(異丙基-β-D-硫代半乳糖苷)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)[13]。但I(xiàn)PTG具有潛在毒性,過(guò)量添加對(duì)菌體生長(zhǎng)具有一定的抑制作用[14]。隨著IPTG濃度增加,Pst I酶產(chǎn)率呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì)(圖3-a),同時(shí)菌體量隨IPTG誘導(dǎo)濃度的增加而呈現(xiàn)不斷降低(圖3-b),因此Pst I菌株最佳IPTG誘導(dǎo)濃度為1.4 mmol/L。

a-菌體濃度;b-酶產(chǎn)率

圖3 IPTG誘導(dǎo)劑濃度對(duì)菌體生長(zhǎng)及酶產(chǎn)率的影響

Fig.3 Effect of IPTG concentrations on the growth of engineering bacteria and Pst I production

2.1.4 優(yōu)化補(bǔ)充碳源

在高密度發(fā)酵中,通常需要添加額外碳源,以滿足大腸桿菌高密度發(fā)酵的要求[15]。大腸桿菌高密度發(fā)酵中常用碳源有葡萄糖、甘油、蔗糖與麥芽糖[16]。由圖4可知在甘油、葡萄糖、麥芽糖與蔗糖中,使用甘油作為額外碳源酶Pst I酶產(chǎn)率與菌體量最高,考慮到使用甘油作為補(bǔ)充碳源,可以減少發(fā)酵過(guò)程中乙酸積累,有利于菌體的生長(zhǎng)。因此Pst I菌株最適補(bǔ)充碳源為甘油。

圖4 碳源對(duì)菌體生長(zhǎng)及酶產(chǎn)率的影響

Fig.4 Effect of carbon sources on the growth of engineering bacteria and Pst I production

2.1.5 優(yōu)化pH值

pH作為影響發(fā)酵的關(guān)鍵因素之一,其對(duì)高密度發(fā)酵中的菌體量與酶產(chǎn)率具有較大影響[17-18]。大腸桿菌生長(zhǎng)pH范圍為5.35～9.72,最適宜pH為7.79[19]。由圖5可知,菌體量在pH 5.0～9.0呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì),pH 5.0～8.0菌體量持續(xù)增加,pH在8.0～9.0,菌體量開(kāi)始降低。Pst I酶產(chǎn)率隨pH的改變也呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì),在pH 8.0時(shí)為最高酶產(chǎn)率。使用Expasy在線工具對(duì)Pst I蛋白的等電點(diǎn)進(jìn)行計(jì)算[20],可知Pst I蛋白的等電點(diǎn)為8.34。同時(shí)由大腸桿菌的最適pH為7.79和本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果,推測(cè)Pst I菌株最適發(fā)酵pH為8.0。

圖5 pH值對(duì)菌體生長(zhǎng)及酶產(chǎn)率的影響

Fig.5 Effect of pH on the growth of engineering bacteria and Pst I production

2.1.6 優(yōu)化誘導(dǎo)時(shí)機(jī)

對(duì)Pst I重組表達(dá)菌株進(jìn)行生長(zhǎng)曲線測(cè)定可以確定菌株生長(zhǎng)情況,從而為優(yōu)化誘導(dǎo)時(shí)機(jī)提供依據(jù)。由Pst I菌體生長(zhǎng)曲線可知(圖6-a),0～3 h為菌體生長(zhǎng)延滯期,3～15 h為菌體生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期,15 h之后進(jìn)入平臺(tái)期。添加誘導(dǎo)劑的時(shí)間一般為為菌體的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的前期或者中期[21]。為了篩選得到合適的誘導(dǎo)時(shí)機(jī),根據(jù)菌體生長(zhǎng)曲線與課題組已有相關(guān)實(shí)驗(yàn),在發(fā)酵進(jìn)行到2、4、6與8 h時(shí)分別添加終濃度1.4 mmol/L的IPTG,進(jìn)行最佳誘導(dǎo)時(shí)機(jī)篩選實(shí)驗(yàn)。

結(jié)果表明(圖6-b),菌體量在誘導(dǎo)時(shí)機(jī)2～8 h內(nèi)呈現(xiàn)波動(dòng)趨勢(shì),同時(shí)Pst I酶產(chǎn)率也隨誘導(dǎo)時(shí)機(jī)的不斷增加而呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)。誘導(dǎo)時(shí)機(jī)為6 h時(shí)獲得最高菌體量與酶產(chǎn)率,同時(shí)由生長(zhǎng)曲線可知6 h位于菌體生長(zhǎng)的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期,菌體生長(zhǎng)旺盛,更適合目標(biāo)蛋白的積累。因此Pst I菌株最適誘導(dǎo)時(shí)機(jī)為6 h。本研究采用GpC廣譜甲基化修飾保護(hù)的策略來(lái)重組表達(dá)限制酶,會(huì)引起基因組的大范圍過(guò)度甲基化,而甲基化會(huì)抑制大多數(shù)基因轉(zhuǎn)錄,從而導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)受到影響。因此在Pst I等限制酶重組表達(dá)過(guò)程中,發(fā)酵菌液的OD600明顯低于普通大腸桿菌發(fā)酵[22]。

a-菌體濃度；b-酶產(chǎn)率

圖6 誘導(dǎo)時(shí)機(jī)對(duì)菌體生長(zhǎng)及酶產(chǎn)率的影響

Fig.6 Effect of induction times on the growth of engineering bacteria and Pst I production

2.2 Pst I 蛋白純化與酶活力分析

使用優(yōu)化的發(fā)酵方案：控制發(fā)酵體系pH 8.0,溫度37 ℃,當(dāng)發(fā)酵進(jìn)行到6 h時(shí),補(bǔ)加終濃度1.4 mmol/L IPTG進(jìn)行誘導(dǎo),誘導(dǎo)后發(fā)酵時(shí)長(zhǎng)為8 h。發(fā)酵結(jié)束后離心收集菌體,破碎細(xì)胞后依次使用Ni親和層析柱與肝素親和層析柱進(jìn)行純化,并用SDS-PAGE分析。由圖7可知蛋白條帶清晰明顯,條帶對(duì)應(yīng)分子量符合目的蛋白(40.7 kDa)。經(jīng)NanoDrop Lite 分光光度計(jì)測(cè)定蛋白濃度,換算得到優(yōu)化后的Pst I蛋白產(chǎn)率為0.0129 g/L,酶產(chǎn)率為1.926×106 U/L。

a-Pst I Ni柱純化結(jié)果，M-marker，1-5分別為使用不同濃度咪唑的洗脫液，6-含有目的蛋白的洗脫液，7-標(biāo)注的蛋白條帶；b-Pst I 肝素柱純化結(jié)果，M-marker，1和2為使用肝素純化后的目的蛋白，3-標(biāo)注的蛋白條帶

圖7 SDS-PAGE分析重組Pst I蛋白純化結(jié)果

Fig.7 SDS-PAGE of purified recombinant Pst I protein

而相關(guān)企業(yè)使用優(yōu)化前的條件,在發(fā)酵罐中所獲得的蛋白產(chǎn)率僅為0.006 g/L,酶產(chǎn)率僅為5.14×105 U/L。可見(jiàn)發(fā)酵工藝經(jīng)過(guò)優(yōu)化后,Pst I的蛋白產(chǎn)率提高到2.15倍,酶產(chǎn)率提高到3.74倍(圖8)。

圖8 優(yōu)化前與優(yōu)化后蛋白產(chǎn)率與酶產(chǎn)率比較

Fig.8 Protein yield and active enzyme yield before and after optimization

3 結(jié)論

本研究以實(shí)驗(yàn)室前期通過(guò)廣譜甲基化保護(hù),初步實(shí)現(xiàn)了部分限制性內(nèi)切酶的國(guó)產(chǎn)化生產(chǎn)的前提下,以限制性內(nèi)切酶Pst I為對(duì)象,進(jìn)行了高密度發(fā)酵工藝的初步探索。通過(guò)單因素試驗(yàn)篩選了誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)時(shí)間、誘導(dǎo)劑濃度、補(bǔ)充碳源、pH值與誘導(dǎo)時(shí)機(jī)等多個(gè)發(fā)酵條件。結(jié)果表明,在37 ℃下,開(kāi)始發(fā)酵后6 h,添加終濃度1.4 mmol/L IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)發(fā)酵8 h,以甘油為補(bǔ)充碳源,控制發(fā)酵體系pH為8.0。在此發(fā)酵條件下Pst I蛋白產(chǎn)量為0.0129 g/L,為未優(yōu)化的2.15倍,同時(shí)酶產(chǎn)率為1.926×106 U/L,為未優(yōu)化的3.74倍。后續(xù)還需要進(jìn)一步優(yōu)化條件,繼續(xù)提升菌體濃度和酶產(chǎn)率,以實(shí)現(xiàn)高密度發(fā)酵。本研究建立的發(fā)酵工藝已被用于Pst I的商業(yè)化生產(chǎn),并可以為其他限制性內(nèi)切酶的大規(guī)模生產(chǎn)提供參考依據(jù)。