沙棘原漿蘋果酸-乳酸發(fā)酵過程中理化指標(biāo)及抗氧化能力的變化

沙棘果實(shí)含有黃酮、酚類化合物、脂肪酸和維生素A、C、E等多種功效成分,具有很高的生物學(xué)價(jià)值[1]。作為純天然的膳食補(bǔ)充劑,以新鮮的沙棘果實(shí)加工而成的沙棘原漿備受消費(fèi)者歡迎。但沙棘果有機(jī)酸含量較高,其中以蘋果酸和奎寧酸為主,約占總酸90%[2],原漿口感過于酸澀,無法直接飲用。

降低酸度是改善原漿口感的有效方法,目前應(yīng)用于果汁的降酸方法包括物理降酸法、化學(xué)降酸法和生物降酸法。生物降酸法是利用微生物進(jìn)行蘋果酸-乳酸發(fā)酵(malolactic fermentation,MLF),MLF可將雙羧基的蘋果酸轉(zhuǎn)化為單羧基的乳酸[3],從而降低總酸中蘋果酸的含量,口味也會(huì)變得更加柔和圓潤(rùn)。該法因降酸效果明顯,且有助于改善口感和風(fēng)味,因此比其他方法更受歡迎[4]。具有蘋果酸-乳酸轉(zhuǎn)化能力的微生物主要為乳酸菌中的乳球菌屬、乳桿菌屬和片球菌屬等,MLF用于葡萄酒后發(fā)酵的研究和應(yīng)用已經(jīng)較為廣泛。近年來,將MLF應(yīng)用于高蘋果酸含量果汁的研究越來越多。其中酒酒球菌表現(xiàn)出更強(qiáng)的對(duì)低pH果汁的耐受性,其可通過MLF降低高酸度果汁北五味子和青梅汁中蘋果酸含量,同時(shí)增強(qiáng)了果汁的抗氧化活性[5-6]。

目前,國(guó)內(nèi)有關(guān)沙棘與其他果汁復(fù)合飲料的研究較多,將酒酒球菌應(yīng)用于沙棘果酒也有報(bào)道。但對(duì)沙棘原漿的MLF尚未見深入研究。本試驗(yàn)以高酸度大果沙棘原漿為原料,接種酒酒球菌CICC 6066,測(cè)定發(fā)酵過程中有機(jī)酸、單糖、黃酮醇、酚酸含量和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)及抗氧化活性的動(dòng)態(tài)變化,以明確酒酒球菌發(fā)酵對(duì)沙棘原漿理化指標(biāo)、生物活性物質(zhì)的含量及抗氧化能力等的影響,為高蘋果酸含量原漿的利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

沙棘原漿,張北寶得康食品有限公司；酒酒球菌CICC 6066凍干粉,上海保藏生物技術(shù)中心。

ATB培養(yǎng)基,上海瑞楚生物科技有限公司；DPPH、三吡啶基三嗪(2,4,6-tripyridin-2-yl-1,3,5-triazine,TPTZ)、ABTS、沒食子酸、檸檬酸、草酸、乳酸、DL-蘋果酸、奎寧酸、槲皮素、山奈酚、異鼠李素、葡萄糖、果糖、蔗糖、山梨醇、鼠李糖,上海易恩化學(xué)技術(shù)有限公司；香豆素、咖啡酸、阿魏酸、兒茶酸、表兒茶酸,上海麥克林生化科技有限公司；上述所有藥品均為分析純；乙腈、甲醇、冰乙酸(均為色譜純),抗壞血酸(分析純),天津歐博凱化工有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

PB-21型pH計(jì),賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；KQ-50DA數(shù)控超聲波清洗器,昆山市超聲儀器有限公司；MultiSkan FC酶標(biāo)儀,賽默飛世爾科技公司；ZHJH-C1214C垂直流超凈工作臺(tái),上海智城分析儀器制造有限公司；C-2L-ARE旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器,上海舍巖儀器有限公司；UV-2700紫外可見分光光度計(jì)、LC-20AT高效液相色譜儀,日本島津公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 發(fā)酵種子液的制備

將酒酒球菌CICC 6066凍干粉用0.2 mL的溶解液溶解混合均勻,吸取100 μL接種到ATB斜面培養(yǎng)基中,25 ℃培養(yǎng)2 d,從斜面培養(yǎng)基中挑取1環(huán)接入ATB液體培養(yǎng)基中,25 ℃培養(yǎng)2 d,連續(xù)活化2次,將所得菌液離心(4 000 r/min,10 min),并用生理鹽水洗滌2次后再次離心,棄去上清液,收集菌泥；用生理鹽水重懸,調(diào)整細(xì)胞濃度為1×109 CFU/mL作為發(fā)酵種子液。

1.3.2 發(fā)酵沙棘原漿的制備

沙棘原漿初始pH為2.70,可溶性固形物為12.30%。用NaHCO3(1 mol/L)溶液調(diào)其pH至3.5,調(diào)酸后沙棘漿的色澤無明顯變化,呈橙黃色。然后接種酒酒球菌CICC 6066種子發(fā)酵液,接種量為5%,使初始菌數(shù)達(dá)到1×107 CFU/mL。對(duì)接種后沙棘漿進(jìn)行分裝,每份100 mL分裝于200 mL三角瓶中,置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱發(fā)酵8 d,每2 d取樣分析,并留樣置-80 ℃凍存,備用。

1.3.3 微生物及理化指標(biāo)的測(cè)定

活菌數(shù)的測(cè)定參照GB 4789.35—2016；pH值使用pH計(jì)直接測(cè)定；可溶性固形物含量的測(cè)定參照NY/T 2637—2014；總酸的測(cè)定參照GB/T 12456—2021；總糖的測(cè)定采用苯酚硫酸法[7]。

1.3.4 有機(jī)酸的測(cè)定

參照文獻(xiàn)[8]的方法,稍作修改。色譜條件為色譜柱：InertSustain-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)；流動(dòng)相：0.05 mol/L KH2PO4溶液(pH 2.70)；等度洗脫20 min；流速0.6 mL/min；紫外檢測(cè)器,波長(zhǎng)210 nm；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量20 μL。

準(zhǔn)確稱取草酸、抗壞血酸各0.10 g(精確至0.000 1 g),乳酸、奎寧酸各0.20 g,蘋果酸、檸檬酸各0.40 g,流動(dòng)相定容于100 mL容量瓶中,配制成質(zhì)量濃度分別為1 000、1 000、2 000、2 000、4 000、4 000 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

精密移取10 mL沙棘汁至100 mL容量瓶,用流動(dòng)相定容,然后用0.45 μm微孔濾膜過濾后直接進(jìn)樣。

1.3.5 糖和糖醇的測(cè)定

參照GB 5009.8—2016的方法。色譜柱：ZXBridge Amide(粒徑3.5 μm,4.6 mm×250 mm)；檢測(cè)器為示差折光檢測(cè)器；流動(dòng)相為90%乙腈水(含0.1%氨水)；流速1.0 mL/min；檢測(cè)器溫度40 ℃；柱溫40 ℃；進(jìn)樣量10 μL。

分別稱取果糖、葡萄糖、蔗糖、鼠李糖和山梨醇各1 g(精確至0.1 g),用水定容至50 mL容量瓶中,配制成質(zhì)量濃度均為20 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

準(zhǔn)確移取1 mL發(fā)酵液到50 mL離心管,加入10 mL水后,再依次加入2 mL ZnSO4和2 mL亞鐵氰化鉀,渦旋1 min,用水定容到25 mL,10 000 r/min離心5 min后取上清液,0.45 μm微孔濾膜過濾后直接進(jìn)樣。

1.3.6 黃酮醇的測(cè)定

參照文獻(xiàn)[9]的方法,略作修改。色譜柱：InertSustain-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)；流動(dòng)相：V(甲醇)∶V(0.4%磷酸水溶液)=50∶50；等度洗脫45 min；流速1.0 mL/min；紫外檢測(cè)器,波長(zhǎng)360 nm,柱溫35 ℃,進(jìn)樣量20 μL。

精確稱取槲皮素、山奈酚、異鼠李素各10 mg(精確至0.1 mg),用甲醇定容于100 mL容量瓶中,配制成質(zhì)量濃度均為100 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

準(zhǔn)確吸取發(fā)酵液2 mL于50 mL離心管中,加入10 mL甲醇振蕩1 min,10 000 r/min離心10 min,取上清液,0.22 μm微孔濾膜過濾后直接進(jìn)樣。

1.3.7 酚酸的測(cè)定

參照文獻(xiàn)[10]的方法,略作修改。色譜柱：InertSustain-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)；流動(dòng)相：A,V(蒸餾水)∶V(冰乙酸)=99∶1；B,V(蒸餾水)∶V(乙腈)∶V(冰乙酸)=67∶31∶1；流速1.0 mL/min；紫外檢測(cè)器,波長(zhǎng)280 nm,柱溫30 ℃；進(jìn)樣量20 μL。梯度洗脫0 min,B：10%；0～10 min,B：20%；10～16 min,B：20%～40%；16～20 min,B：40%～50%；20～25 min,B：50%；16～30 min,B：70%；30～40 min,B：70%～10%；40～75 min,B：10%。

精確稱取香豆素、兒茶酸、表兒茶酸、阿魏酸、咖啡酸、沒食子酸、對(duì)羥基苯甲酸各10 mg(精確至0.1 mg),分別用甲醇定容于100 mL容量瓶中,配制成質(zhì)量濃度均為100 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

樣品處理參照文獻(xiàn)[11]的方法,發(fā)酵漿中加入乙酸乙酯(體積比為1∶1),充分混勻,萃取3次,取上清液,然后于45 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機(jī)溶劑,蒸干后的剩余部分用4 mL甲醇溶解,溶解液經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾后直接進(jìn)樣。

1.3.8 SOD活力測(cè)定

發(fā)酵漿離心(8 000 r/min,10 min)后取上清液稀釋10倍,參照GB/T 5009.171—2003和郭偉峰等[12]的方法測(cè)定。

1.3.9 抗氧化能力的測(cè)定

·OH清除能力的測(cè)定采用Fenton法；DPPH自由基和ABTS陽離子自由基清除能力的測(cè)定參照文獻(xiàn)清除能力的測(cè)定和總抗氧化能力(ferric ion reducing antioxidant power,FRAP)測(cè)定參照文獻(xiàn)[14]的方法。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)用Excel 2010、SPSS 26.0軟件進(jìn)行方差分析和相關(guān)性分析。每個(gè)指標(biāo)測(cè)定均重復(fù)3次,取平均值,結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 沙棘原漿MLF過程中微生物及理化指標(biāo)的變化

沙棘原漿發(fā)酵過程中微生物及主要理化指標(biāo)變化如表1所示,沙棘漿的活菌數(shù)顯著增加,發(fā)酵第6天達(dá)到最高(9.66 lg CFU/mL),沙棘漿pH從初始3.50持續(xù)升高,發(fā)酵第4天達(dá)到3.91,與發(fā)酵第8天(3.98)無顯著性差異；而發(fā)酵過程中可溶性固形物、總酸和總糖的含量均顯著降低,這與酒酒球菌以有機(jī)酸和糖作為碳源發(fā)酵利用有關(guān)。由于酸性條件下,酒酒球菌優(yōu)先利用有機(jī)酸,因此總酸降低幅度較大。沙棘漿發(fā)酵后總酸降低59.61%,總糖降低19.08%,糖酸比從2.40增加到4.80。糖酸比的增加有助于沙棘原漿口感的改善。

表1 沙棘原漿發(fā)酵過程中微生物及理化指標(biāo)的變化

Table 1 Changes in microbes and physical and chemical indexes of sea buckthorn puree during fermentation

注：同行小寫字母不同表示組間存在顯著性差異(P<0.05)(下同)

2.2 沙棘原漿MLF過程中有機(jī)酸含量的變化

標(biāo)準(zhǔn)有機(jī)酸和發(fā)酵沙棘漿有機(jī)酸HPLC(分離詳細(xì)色譜圖見電子版增強(qiáng)附件圖1和圖2),對(duì)比可確定沙棘漿中含有草酸、奎寧酸、DL-蘋果酸、抗壞血酸、乳酸和檸檬酸等6種有機(jī)酸。

發(fā)酵前后沙棘漿中有機(jī)酸含量的變化見表2。發(fā)酵前有機(jī)酸以DL-蘋果酸和奎寧酸為主,發(fā)酵后有機(jī)酸比例發(fā)生了明顯變化,以乳酸和奎寧酸為主。MLF發(fā)酵的重要標(biāo)志是蘋果酸轉(zhuǎn)化為乳酸,發(fā)酵8 d后,沙棘原漿中蘋果酸由22.58 mg/mL降低到3.16 mg/mL,蘋果酸降解率達(dá)到86.01%；結(jié)果還顯示發(fā)酵6 d,蘋果酸含量為3.20 mg/mL,與發(fā)酵8 d無顯著性差異,說明發(fā)酵6 d已達(dá)到了蘋果酸降解的最高值；乳酸含量增加了3.79倍,達(dá)到29.58 mg/mL。表明酒酒球菌CICC 6066在此沙棘漿發(fā)酵過程中能夠產(chǎn)生蘋果酸乳酸酶,催化蘋果酸轉(zhuǎn)化為乳酸。張晟等[5]優(yōu)化北五味子MLF后蘋果酸降解率達(dá)到了59%。本研究計(jì)劃下一步優(yōu)化發(fā)酵工藝,以進(jìn)一步提高蘋果酸降解率。

同時(shí),由表2還可看出檸檬酸含量也有所降低,何翠嬋等[6]用酒酒球菌發(fā)酵青梅汁,也證實(shí)該菌可利用檸檬酸作為碳源。另外,發(fā)酵后抗壞血酸含量降低,主要原因可能是抗壞血酸屬于烯醇化合物,化學(xué)性質(zhì)極不穩(wěn)定,容易發(fā)生氧化反應(yīng)形成醌類物質(zhì),洪冰[15]和郝媛等[16]的研究也得出相同的結(jié)論。發(fā)酵前后,沙棘原漿中奎寧酸和草酸沒有顯著變化。

表2 沙棘原漿發(fā)酵過程中有機(jī)酸含量的變化

Table 2 Changes in organic acids of sea buckthorn puree during fermentation

2.3 沙棘原漿MLF過程中糖的變化

標(biāo)準(zhǔn)糖和發(fā)酵沙棘漿糖HPLC分離詳細(xì)色譜圖見電子版增強(qiáng)附件圖3和圖4,通過比對(duì)可確定沙棘漿中含有葡萄糖和果糖2種單糖。

TKACZ等[1]從試驗(yàn)所用沙棘汁中檢測(cè)出葡萄糖、果糖、蔗糖、鼠李糖和山梨醇等5種糖和糖醇,而本試驗(yàn)從大果沙棘原漿中僅檢測(cè)出葡萄糖和果糖2種單糖(表3),所含糖的種類和數(shù)量不同可能與沙棘品種有關(guān)。發(fā)酵過程中,2種單糖含量均顯著減少；發(fā)酵第8天,葡萄糖和果糖分別降低了23.25%和32.17%;表明酒酒球菌具有一定的利用還原糖作為碳源的能力,何翠嬋等[6]研究也發(fā)現(xiàn)酒酒球菌在添加了葡萄糖的青梅汁中,生長(zhǎng)速率顯著加快,葡萄糖對(duì)其生長(zhǎng)有促進(jìn)作用。另外,葡萄糖的含量在發(fā)酵4 d時(shí)為11.92 mg/mL,此后并無顯著性降低,果糖的降解速度在4 d后顯著變緩慢,說明這2種糖在酒酒球菌進(jìn)入指數(shù)生長(zhǎng)期后(4 d)降解速率均減慢。

表3 沙棘原漿發(fā)酵過程中糖的變化

Table 3 Changes in monosaccharides of sea buckthorn puree during fermentation

2.4 沙棘原漿MLF過程中黃酮醇和酚酸的變化

標(biāo)準(zhǔn)黃酮醇、酚酸和發(fā)酵沙棘漿黃酮醇、酚酸HPLC分離詳細(xì)色譜圖見電子版增強(qiáng)附件圖5～圖8,通過對(duì)比可確定沙棘中有槲皮素、山奈酚和異鼠李素3種黃酮醇和沒食子酸、對(duì)羥基苯甲酸、兒茶酸、咖啡酸、表兒茶酸、阿魏酸、香豆素等7種酚酸。

采用高效液相色譜法測(cè)定了沙棘原漿發(fā)酵過程中黃酮醇和酚酸的變化,見表4。沙棘原漿中黃酮醇以異鼠李素為主,占比56.37%。發(fā)酵后各黃酮醇的含量均顯著增加,發(fā)酵第8天,總黃酮醇(3.913 mg/L)較原汁增加了49.35%,可能是部分黃酮類物質(zhì)與不溶性膳食纖維結(jié)合,酒酒球菌發(fā)酵過程中產(chǎn)生的酶,使這部分黃酮釋放為水溶性黃酮苷,導(dǎo)致各黃酮醇含量的增加[17]。

表4 沙棘原漿發(fā)酵過程中黃酮醇和酚酸含量的變化

Table 4 Changes in flavonols and phenolic acids of sea buckthorn puree during fermentation

除表兒茶酸外,各酚酸也均呈顯著增加的趨勢(shì)。發(fā)酵8 d后,總酚酸含量達(dá)到156.78 mg/L,較原漿增加了29.63%；酚酸含量最高的仍為沒食子酸,占比33.89%,對(duì)羥基苯甲酸和兒茶酸各增加了59.80%和65.50%?？偟膩碚f,可能是由于酚類化合物進(jìn)行了去糖基化反應(yīng),植物細(xì)胞壁上釋放出了可溶性共軛或不溶性的酚類化合物,使得酚酸的含量增高[18]。

2.6 沙棘原漿MLF過程中SOD活力變化

乳酸菌發(fā)酵可產(chǎn)生一些功能性酶類,如SOD。作為一種體內(nèi)的天然清除劑,SOD活性已成為評(píng)價(jià)保健食品抗衰老的重要指標(biāo)[19]。由圖1可知,沙棘原漿隨著發(fā)酵的進(jìn)行,SOD活力顯著增加,第8天酶活力達(dá)到4 454.54 U/mL,為未發(fā)酵沙棘原漿的8.06倍。

圖1 沙棘原漿發(fā)酵過程中SOD活力變化

Fig.1 Activity of SOD in sea buckthorn puree during fermentation

郭偉峰等[12]以SOD活力為指標(biāo),優(yōu)化桑葚酵素的發(fā)酵工藝后SOD活力提高了123%,可達(dá)24 122.2 U/mL。表明乳酸菌發(fā)酵能顯著提高果汁的SOD活力。

2.7 沙棘原漿MLF過程中抗氧化能力的變化

過量超氧化物自由基的存在會(huì)加速機(jī)體的氧化衰老,因此清除自由基的能力常被作為評(píng)價(jià)食品抗氧化活性的指標(biāo)[20]。由表5可知,發(fā)酵后,沙棘汁的各抗氧化指標(biāo)均顯著增強(qiáng)(P>0.05),發(fā)酵第8天后分別較未發(fā)酵原汁提高了18.22%、9.92%、40.23%、5.90%和16.41%。表明酒酒球菌發(fā)酵沙棘漿可提高其抗氧化能力,這與發(fā)酵后沙棘漿黃酮醇、酚酸等天然抗氧化物質(zhì)含量顯著增加有直接關(guān)系,相關(guān)性分析表明,總酚酸和DPPH,ABTS及FRAP之間顯著正相關(guān),Pearson相關(guān)系數(shù)分別為0.977,0.984和0.905。

表5 沙棘原漿發(fā)酵過程中各抗氧化能力的變化

Table 5 Changes in antioxidant capacity of sea buckthorn puree during fermentation

3 結(jié)論

本研究利用酒酒球菌CICC 6066發(fā)酵沙棘原漿,該菌在沙棘原漿中生長(zhǎng)能力較強(qiáng),發(fā)酵4 d菌數(shù)達(dá)到9.59 lg CFU/mL,且表現(xiàn)出較好的蘋果酸-乳酸轉(zhuǎn)化能力,使沙棘漿中蘋果酸降解86.01%,乳酸占比由9.86%增加到49.75%,pH值升高了0.48；同時(shí),酒酒球菌還可利用葡萄糖和果糖作為碳源,但利用有機(jī)酸能力更強(qiáng),發(fā)酵后糖酸比提高了2.50。發(fā)酵沙棘漿的黃酮醇和酚酸分別比未發(fā)酵沙棘原漿增加了49.35%和29.63%,總量達(dá)到160.71 mg/L；由于抗氧化物質(zhì)含量的增加,發(fā)酵沙棘漿的SOD活力及體外抗氧化活性均顯著性提高。本研究還表明,發(fā)酵第6天蘋果酸降解率達(dá)到最大值,研究結(jié)果為進(jìn)一步優(yōu)化高酸度果漿的MLF工藝提供了參考。