高產(chǎn)胞外多糖嗜熱鏈球菌的篩選及其直投式發(fā)酵劑的應(yīng)用

乳酸菌胞外多糖(exopolysaccharide,EPS)是指乳酸菌在菌體生長(zhǎng)過程中產(chǎn)生并分泌到細(xì)胞外、常滲入到培養(yǎng)基中的一種天然高分子聚合物[1]。乳酸菌是公認(rèn)的安全級(jí)(Generally Regarded As Safe,GRAS)、綠色食品微生物,其所產(chǎn)EPS也被認(rèn)為是安全可靠的,具有多種生物活性,包括抗氧化、抗腫瘤、降血糖、增強(qiáng)免疫力以及調(diào)節(jié)腸道菌群等[2-5]。乳酸菌EPS在抗氧化方面的優(yōu)良特性,使其可以作為一種安全、無毒和來源廣泛的天然抗氧化劑,是目前研究的熱點(diǎn)。此外,乳酸菌EPS具有的多種理化特性使其可以作為理想的穩(wěn)定劑和增黏劑應(yīng)用于發(fā)酵食品中,起到改善乳制品口感、流變學(xué)特性和防止乳清析出的作用,使產(chǎn)品更穩(wěn)定、質(zhì)地更細(xì)膩[6]。

目前從我國(guó)傳統(tǒng)發(fā)酵食品中分離出的產(chǎn)EPS的乳酸菌有嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus)、腸膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)、植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)、嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)和瑞士乳桿菌(Lactobacillus helveticus)等[7-9]。其中S.thermophilus是鏈球菌屬中唯一可應(yīng)用在發(fā)酵食品中的菌株,是優(yōu)良的基礎(chǔ)發(fā)酵劑。目前高產(chǎn)EPS菌種資源相對(duì)匱乏,導(dǎo)致其廣泛的開發(fā)和應(yīng)用受到限制?？茖W(xué)家們也試圖用基因工程的手段構(gòu)建高產(chǎn)EPS菌株,但目前仍未取得較大進(jìn)展[10]。

本研究擬從我國(guó)傳統(tǒng)發(fā)酵食品中分離出高產(chǎn)EPS的乳酸菌,并進(jìn)行分離提取,對(duì)LAB的生物學(xué)特性和其產(chǎn)EPS的抗氧化特性進(jìn)行分析,同時(shí)探索乳酸菌制備的直投式發(fā)酵劑(directed vat set,DVS)在發(fā)酵乳中的應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

分菌樣品酸奶、奶疙瘩、牦牛奶、駱駝奶、酥油、發(fā)酵面團(tuán)、泡菜等采自于新疆、西藏、貴州、青海和四川等地。

MRS培養(yǎng)基,廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；M17培養(yǎng)基,青島海博科技工業(yè)園生物科技有限公司；細(xì)菌基因組DNA快速抽提試劑盒,生工生物工程股份有限公司；API 50 CH碳水化合物鑒定試劑條、厭氧袋,法國(guó)生物梅里埃股份有限公司。

脫脂乳培養(yǎng)基：脫脂乳粉120 g,蔗糖20 g,葡萄糖20 g,蒸餾水840 mL,均質(zhì),105 ℃滅菌10 min。

1.2 儀器與設(shè)備

KB240生化培養(yǎng)箱,德國(guó)Binder公司；高速冷凍離心機(jī),Eppendorf 股份公司；OLYMPUS BX61光學(xué)顯微鏡,Olympus 株式會(huì)社；FE20數(shù)顯pH計(jì),梅特勒-托利多公司；MyCyler PCR儀,Bio-RAD公司；DU800 紫外分光光度計(jì),Beckman公司；DV2T黏度計(jì),BROOKFIELD公司；AFL-W15A 乳品發(fā)酵監(jiān)控儀,AMS Alliance iCinac公司；Bioscreen全自動(dòng)生長(zhǎng)曲線分析儀,Bioscreen公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 菌株分離純化

取5 mL(或g)待分離樣品加入裝有45 mL生理鹽水的藍(lán)蓋瓶中,攪拌混勻后,用生理鹽水梯度稀釋至適宜濃度,振蕩混勻。取100 μL混勻樣品液,分別涂布于MRS和M17培養(yǎng)基平板,37 ℃厭氧培養(yǎng)48 h。挑選具有乳酸菌特征的菌落,于平板上反復(fù)三區(qū)劃線,獲得純菌株,于-80 ℃冷凍保存。

1.3.2 發(fā)酵性能優(yōu)良菌株的篩選

菌株活化2代后,以2%(體積分?jǐn)?shù))接種量接種于100 mL脫脂乳培養(yǎng)基,37 ℃靜置培養(yǎng)至脫脂乳凝固,觀察并記錄凝乳狀態(tài)。對(duì)得到的酸乳進(jìn)行評(píng)價(jià),評(píng)價(jià)指標(biāo)主要包括組織狀態(tài)、拉絲長(zhǎng)度、黏度和風(fēng)味等,篩選出發(fā)酵性能優(yōu)良菌株。

1.3.3 產(chǎn)EPS菌株的篩選

1.3.3.1 EPS的提取和純化

采用劉剛等[11]的方法并稍作修改。菌株活化2代后,以2%(體積分?jǐn)?shù))接種量接種于脫脂乳培養(yǎng)基中,37 ℃恒溫靜置培養(yǎng)24 h后得到發(fā)酵乳。95 ℃水浴加熱發(fā)酵乳10 min以除去其中可能降解EPS的酶,冷卻到室溫。8 000 r/min離心30 min后除去細(xì)胞和部分蛋白沉淀。向上清液中加入800 g/L的三氯乙酸(trichloroacetic acid,TCA)溶液至終質(zhì)量濃度40 g/L,充分?jǐn)嚢? h后4 ℃靜置過夜,12 000 r/min 4 ℃離心40 min得到含EPS的上清液。向上清液中加入3倍體積的預(yù)冷95%乙醇進(jìn)行醇沉,4 ℃靜置過夜,離心得EPS沉淀,加純水溶解即得EPS溶液,裝入透析袋中(截留分子質(zhì)量14 kDa)透析48 h,每8 h換1次水,得到純化EPS溶液。冷凍干燥48 h后,得干燥多糖。

1.3.3.2 EPS含量的測(cè)定

采用苯酚-硫酸法測(cè)定EPS的含量[12]。以葡萄糖含量(mg/L)為橫坐標(biāo),吸光度值為縱坐標(biāo),繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到回歸方程：y=0.009 1x-0.011(R2=0.998 4)。同法測(cè)得分離菌株所產(chǎn)EPS溶液在490 nm處的吸光度,帶入回歸方程計(jì)算EPS產(chǎn)量。

1.3.4 產(chǎn)EPS菌株的鑒定

將菌株于固體培養(yǎng)基劃線,37 ℃培養(yǎng)24 h后,觀察并記錄菌株的形態(tài)特征。挑取平板菌落涂布于載玻片并革蘭氏染色,于顯微鏡下觀察菌體的細(xì)胞形態(tài)。菌株生理生化試驗(yàn)包括糖發(fā)酵特性(API 50 CH鑒定試劑條)、過氧化氫酶試驗(yàn)、液化明膠試驗(yàn)、精氨酸水解試驗(yàn)、硫化氫試驗(yàn)和吲哚試驗(yàn)等。

采用細(xì)菌基因組DNA快速抽提試劑盒得到菌株DNA,并進(jìn)行PCR擴(kuò)增[13],陽性PCR產(chǎn)物送至金唯智生物科技有限公司測(cè)序,測(cè)序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫中應(yīng)用BLAST工具與GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)分析。

1.3.5 菌株生物學(xué)特性分析

1.3.5.1 菌株生長(zhǎng)特性

對(duì)菌株的生長(zhǎng)特性和產(chǎn)酸特性進(jìn)行測(cè)定。菌株活化2代后以2%(體積分?jǐn)?shù))接種量接種于M17液體培養(yǎng)基中,40 ℃恒溫靜置培養(yǎng)24 h,采用細(xì)胞生長(zhǎng)曲線跟蹤儀和酸度跟蹤儀監(jiān)測(cè)菌株生長(zhǎng)過程,并繪制菌株的生長(zhǎng)曲線和產(chǎn)酸曲線。

1.3.5.2 菌株耐酸耐膽鹽特性

菌株活化2代后,取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)末期菌液,離心去上清液,得新鮮菌泥。加入與培養(yǎng)液相同體積的pH值為1.5、2.5、3.5和4.5的M17液體培養(yǎng)基,充分混勻后,置于40 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h,于0、1、2、3和4 h分別取樣,采用稀釋涂布法進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)計(jì)算菌株耐酸性。加入與培養(yǎng)液相同體積的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.03%、0.1%、0.2%和0.3%膽鹽的M17液體培養(yǎng)基,充分混勻后,于40 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,于0、4、8和24 h分別取樣,采用稀釋涂布法進(jìn)行活菌計(jì)數(shù),計(jì)算菌株耐膽鹽性。菌株存活率計(jì)算如公式(1)所示：

菌株存活率

(1)

式中：A1,菌株培養(yǎng)后活菌數(shù)的對(duì)數(shù)值；A2,菌株培養(yǎng)0 h活菌數(shù)的對(duì)數(shù)值。

1.3.6 EPS體外抗氧化性能測(cè)定

取菌株產(chǎn)EPS樣品,配制成不同質(zhì)量濃度(0.2、0.5、1.0、2.0、5.0和8.0 mg/mL)的EPS樣品溶液,并以相同濃度的抗壞血酸(維生素C)做陽性對(duì)照,按照如下方法分別測(cè)定抗氧化指標(biāo)和總還原力。

1.3.6.1 DPPH自由基清除能力的測(cè)定

采用WU等[14]方法并稍作修改。試管中加入2 mL EPS樣品溶液,并加入2 mL 0.2 mmol/L的DPPH-甲醇溶液,混勻后,室溫下于暗處反應(yīng)1 h,測(cè)定517 nm處吸光值。以維生素C作陽性對(duì)照。DPPH自由基清除率計(jì)算如公式(2)所示：

DPPH清除率

(2)

式中：A,以等體積甲醇代替DPPH溶液的吸光度；A0,等體積水替代多糖樣品的吸光度；A1,EPS樣品與DPPH反應(yīng)后的吸光度。

1.3.6.2 ·OH清除能力的測(cè)定

采用Fenton法測(cè)定EPS對(duì)·OH的清除能力[15]。向含有1 mL 0.435 mmol/L的亮綠溶液,2 mL 0.5 mmol/L的FeSO4和1.5 mL 30 g/L H2O2的Fenton反應(yīng)體系中加入1 mL EPS樣品溶液,混勻后,37 ℃水浴 20 min,4 ℃、8 000 r/min離心10 min,取上清液,測(cè)定624 nm處吸光值。以維生素C作陽性對(duì)照?！H清除率計(jì)算如公式(3)所示：

·OH清除率

(3)

式中：A1,Fenton 試劑+樣品+亮綠溶液體系的吸光度；A0,Fenton 試劑+亮綠的溶液體系吸光度；A,僅含亮綠溶液的吸光度。

1.3.6.3 清除能力的測(cè)定

采用姜靜等[16]的方法并稍作修改。向3 mL 50 mmol/L pH 8.2(含1 mmol/L的EDTA)的Tris-HCl緩沖溶液中加入1 mL EPS樣品溶液,混勻,25 ℃水浴靜置20 min,加入300 μL 25 mmol/L鄰苯三酚溶液,混勻,25 ℃水浴反應(yīng)5 min后,立即加入1 mL 鹽酸終止反應(yīng),混勻后,測(cè)定325 nm處吸光值。以維生素C作陽性對(duì)照。清除率按公式(4)計(jì)算：

清除率

(4)

式中：A,只加入Tris-HCl緩沖溶液的吸光度；A0,加入鄰苯三酚溶液的吸光度；A1,終反應(yīng)吸光度。

1.3.6.4 總還原力的測(cè)定

采用鐵氰化鉀法測(cè)定EPS樣品的總還原力[17]。取1 mL EPS樣品溶液于試管中,加入1 mL 0.2 mol/L pH 6.6的PBS,1 mL 10 g/L的鐵氰化鉀溶液,混勻,50 ℃水浴反應(yīng) 20 min后,驟冷,加入1 mL 5%TCA溶液,混勻,4 000 r/min離心10 min,取2.5 mL上清液,加入2.5 mL蒸餾水和0.5 mL 1 g/L FeCl3溶液,混勻,靜置反應(yīng)10 min后,測(cè)定700 nm處吸光值,以O(shè)D700 nm表示EPS樣品的總還原力。OD700 nm值越大,代表還原能力越強(qiáng)。以維生素C作陽性對(duì)照。

1.3.7 DVS的制備

菌株于M17液體培養(yǎng)基活化2代后,以5%(體積分?jǐn)?shù))接種量接種于10 L發(fā)酵罐中進(jìn)行高密度厭氧培養(yǎng),發(fā)酵條件控制為40 ℃、恒pH 6.0,通氣CO2,以發(fā)酵液在OD600 nm處的吸光值不變?yōu)榘l(fā)酵終點(diǎn)。8 000 r/min、4 ℃離心15 min,棄上清液,收集菌體沉淀。用無菌磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)漂洗菌體1次,得到的菌泥與脫脂乳、蔗糖、乳糖、谷氨酸鈉、水等保護(hù)劑成分按一定比例充分?jǐn)嚢杌靹??；旌弦阂浦琳婵绽鋬龈稍餀C(jī)中凍干80 h,得到DVS。

1.3.8 DVS的應(yīng)用

將脫脂乳粉120 g/L,蔗糖80 g/L溶于55 ℃蒸餾水中,均質(zhì),95 ℃滅菌10 min,冷卻。將DVS按最終活菌數(shù)為1.0×106 CFU/mL的接種量接種于滅菌脫脂乳中,40 ℃靜置培養(yǎng)7 h后,于4 ℃冷藏過夜,得到不需要增稠劑的酸乳。采用AFL-W15A乳品發(fā)酵監(jiān)控儀監(jiān)測(cè)發(fā)酵過程pH值變化。對(duì)DVS的發(fā)酵性能進(jìn)行分析：采用數(shù)顯pH計(jì)測(cè)定發(fā)酵乳pH值；依據(jù)GB/T 5009.239—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品酸度的測(cè)定》測(cè)定發(fā)酵乳酸度；采用直尺測(cè)定發(fā)酵乳拉絲長(zhǎng)度(cm)；采用DV2T黏度計(jì)測(cè)定發(fā)酵乳黏度；依據(jù)GB/T 4789.35—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn)乳酸菌檢驗(yàn)》測(cè)定發(fā)酵乳活菌數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

每個(gè)實(shí)驗(yàn)均設(shè)置3次重復(fù),繪圖采用Graph Pad Prism 8軟件,數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0軟件,數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示,顯著水平設(shè)置為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 高產(chǎn)EPS菌株的分離、鑒定與保藏

本研究從各種發(fā)酵樣品中共分離得到483株乳酸菌。經(jīng)過發(fā)酵性能初篩,篩選出6株黏度高、拉絲長(zhǎng)度長(zhǎng)且風(fēng)味良好的菌株(圖1)。其中菌株WHH3379的EPS產(chǎn)量顯著高于其他5株菌,在脫脂乳培養(yǎng)基中的產(chǎn)量為(526.58±2.91)mg/L,高于嗜熱鏈球菌Q4F8的EPS產(chǎn)量[11]。

圖1 菌株胞外多糖產(chǎn)量

Fig.1 Exopolysaccharide yields of strains

注：字母不同表示差異顯著(P<0.05)

WHH3379菌株在M17瓊脂培養(yǎng)基的菌落為圓形,邊緣整齊,略突起,正反面顏色一致,中央與邊緣顏色一致,符合乳酸菌的基本特征(圖2-a)。

顯微鏡下,該菌體呈球形、成對(duì)或成鏈狀、無鞭毛、不運(yùn)動(dòng)、不產(chǎn)芽孢、革蘭氏染色陽性(圖2-b)。

圖2 WHH3379菌落形態(tài)(a)和菌體形態(tài)圖(b)

Fig.2 Colonial(a)and cell morphologies(b)of strain WHH3379

菌株WHH3379可利用葡萄糖、乳糖和蔗糖3種碳水化合物(表1),不液化明膠,不水解精氨酸,不產(chǎn)硫化氫,過氧化氫酶試驗(yàn)和吲哚試驗(yàn)均呈陰性。將菌株WHH3379的16S rRNA基因序列的測(cè)序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫中應(yīng)用BLAST工具與GenBank數(shù)據(jù)庫已有序列進(jìn)行比對(duì)分析,結(jié)果顯示該菌株為嗜熱鏈球菌(S.thermophilus),并將其命名為嗜熱鏈球菌WHH3379。

表1 菌株WHH3379 API 50 CHL發(fā)酵實(shí)驗(yàn)結(jié)果

Table 1 API 50 CHL fermentation profiles of strain WHH3379

注：+:呈陽性;-:呈陰性(下同)

嗜熱鏈球菌WHH3379是從青海海晏縣農(nóng)家自制酥油中分離得到,于2020年6月15日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物菌種保藏中心,微生物保藏編號(hào)為CGMCC No.20089。

2.2 WHH3379生物學(xué)特性分析

2.2.1 WHH3379生長(zhǎng)特性

由圖3可知,嗜熱鏈球菌WHH3379具有良好的生長(zhǎng)情況和產(chǎn)酸速率,反映其較高的乳酸菌活力。嗜熱鏈球菌WHH3379從2 h后快速生長(zhǎng)進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,6 h后即進(jìn)入穩(wěn)定期,顯示出較快的生長(zhǎng)速率；嗜熱鏈球菌WHH3379在接種2 h后開始大量產(chǎn)酸,pH下降迅速,8 h后趨于平穩(wěn),pH為4.10左右,顯示出優(yōu)良的產(chǎn)酸速率。

a-生長(zhǎng)曲線；b-產(chǎn)酸曲線

圖3 嗜熱鏈球菌WHH3379的生長(zhǎng)曲線和產(chǎn)酸曲線

Fig.3 Growth and acid production curves of S.thermophilus WHH3379

2.2.2 WHH3379耐酸耐膽鹽特性

益生菌必須以活菌形態(tài)到達(dá)人體消化道才能更好的發(fā)揮其益生功能,而胃部的低pH環(huán)境會(huì)影響益生菌在腸道的定植[18],所以對(duì)酸的耐受性是衡量?jī)?yōu)良益生菌的重要指標(biāo)。嗜熱鏈球菌WHH3379的耐酸能力如圖4-a所示,隨著pH值的降低和培養(yǎng)時(shí)間的增加,菌株存活率有所降低。但是,在pH為2.5、3.5和4.5的酸度下孵育1 h后菌株存活率均>95%,孵育4 h后菌株存活率仍均>89%。再將pH進(jìn)一步降低到1.5后,嗜熱鏈球菌WHH3379孵育4 h后仍表現(xiàn)出了(72.85±1.18)%的存活率。從傳統(tǒng)酸奶分離出的鼠李糖乳桿菌217-3在pH 1.5孵育4 h后的存活率為72%,來源于酵素液體的菌株B1在pH 1.5孵育4 h后的存活率為(95.57±3.07)%[19]。正常人體胃液的pH值在1.5～4.5波動(dòng)變化,菌株可在pH 1.5～4.5維持較高的存活率,表明嗜熱鏈球菌WHH3379具有優(yōu)良的酸耐受性。

a-酸耐受性；b-膽鹽耐受性

圖4 嗜熱鏈球菌WHH3379對(duì)酸、膽鹽的耐受性測(cè)定

Fig.4 Tolerance of S.thermophilus WHH3379 to acids and bile salts

可以耐受人體小腸環(huán)境中的膽鹽脅迫是衡量?jī)?yōu)良益生菌的重要指標(biāo),也是益生菌發(fā)揮功能的重要前提。嗜熱鏈球菌WHH3379的耐膽鹽能力如圖4-b所示,隨著膽鹽濃度的增加和培養(yǎng)時(shí)間的增加,菌株存活率有所下降。嗜熱鏈球菌WHH3379在膽鹽含量為0.03%和0.1%的條件下孵育24 h后菌株存活率仍均>85%,在膽鹽含量為0.3%的環(huán)境下培養(yǎng)4、8和24 h后的存活率分別為(90.83±1.05)%、(81.33±3.11)%和(73.41±1.45)%。植物乳桿菌KLDS 1.0318在0.3%膽鹽培養(yǎng)4 h后的存活率仍可達(dá)95.40%[18],高于本研究中EPS的清除率。正常人體小腸的膽鹽濃度在0.03%～0.3%波動(dòng)[19],菌株在膽鹽含量為0.03%～0.3%的條件下能夠維持較高水平的存活率,表明嗜熱鏈球菌WHH3379具有較好的膽鹽耐受性。

2.3 WHH3379 EPS體外抗氧化活性分析

2.3.1 DPPH自由基清除能力的測(cè)定

菌株及其產(chǎn)物對(duì)DPPH自由基的清除作用可反映其降低過氧化自由基、烷自由基或脂質(zhì)自由基連鎖反應(yīng)的能力[21]。如圖5所示,隨著WHH3379 EPS質(zhì)量濃度的增加,對(duì)DPPH自由基清除能力也不斷增加,表現(xiàn)出濃度依賴特征,但始終低于維生素C的清除率,當(dāng)維生素C質(zhì)量濃度為1 mg/mL時(shí),清除率即可達(dá)到(90.3±1.35)%。當(dāng)WHH3379 EPS質(zhì)量濃度為5和8 mg/mL時(shí),對(duì)DPPH自由基的清除率分別為(70.4±1.13)%和(79.9±2.26)%。假腸膜明串珠菌GX-3 EPS在質(zhì)量濃度為5 mg/mL 時(shí)的清除率最大為65.34%[22],德式乳桿菌 EPS在質(zhì)量濃度為5 mg/mL時(shí)的DPPH清除率為68.60%[23],均低于本研究中EPS對(duì)DPPH自由基的清除率。

圖5 WHH3379 EPS對(duì)DPPH自由基的清除能力

Fig.5 DPPH radical scavenging capacity of WHH3379 EPS

2.3.2 ·OH清除能力的測(cè)定

·OH是最具反應(yīng)活性和最危險(xiǎn)的自由基,可通過活體免疫作用產(chǎn)生,對(duì)細(xì)胞和生物分子造成嚴(yán)重氧化應(yīng)激損傷,從而導(dǎo)致衰老、癌癥等疾病[24]。如圖6所示,0.2～2 mg/mL質(zhì)量濃度的WHH3379 EPS對(duì)·OH的清除能力>維生素C。當(dāng)WHH3379 EPS質(zhì)量濃度為5和8 mg/mL時(shí),對(duì)·OH的清除率分別(68.9±0.98)%和(73.6±1.58)%,顯示出良好的抗氧化性。融合魏斯氏菌H2產(chǎn)EPS對(duì)·OH的清除能力隨EPS濃度的增加而提高,在5 mg/mL時(shí)的清除率為(42.56±0.16)%[16]。

圖6 WHH3379 EPS對(duì)·OH的清除能力

Fig.6 Hydroxyl radical scavenging capacity of WHH3379 EPS

清除能力的測(cè)定

是活性自由基的前體物質(zhì),可以與生物活性分子發(fā)生反應(yīng),造成脂質(zhì)、DNA和蛋白質(zhì)等的氧化損傷[25]。如圖7所示,隨著WHH3379 EPS濃度的增加,對(duì)的清除率呈現(xiàn)不斷提高后保持平穩(wěn)的趨勢(shì),但始終低于維生素C。在WHH3379 EPS質(zhì)量濃度為5和8 mg/mL時(shí),對(duì)清除率達(dá)到(60.3±0.21)%和(61.0±1.38)%。葉廣彬等[23]研究發(fā)現(xiàn)假腸膜明串珠菌GX-3 EPS在質(zhì)量濃度為5 mg/mL時(shí)對(duì)的清除率最大為(77.48±2.45)%,高于本研究EPS對(duì)的清除率。

圖7 WHH3379 EPS對(duì)的清除能力

Fig.7 Superoxide anion radical scavenging capacity of WHH3379 EPS

2.3.4 總還原力的測(cè)定

EPS可以通過提供氫原子的方式來阻斷過氧化物的形成,破壞自由基反應(yīng)鏈,防止氧化損傷,從而達(dá)到抗氧化效果。如圖8所示,WHH3379 EPS的總還原力與樣品濃度呈正相關(guān),但始終低于維生素C。WHH3379 EPS在質(zhì)量濃度為5和8 mg/mL時(shí),其總還原力為(1.234±0.35)和(1.213±0.88),顯著高于戊糖片球菌 SR2-2的EPS[26]。

圖8 WHH3379 EPS總還原力

Fig.8 Total reducing power of WHH3379 EPS

2.4 DVS的制備和應(yīng)用

由高產(chǎn)EPS的嗜熱鏈球菌WHH3379制得DVS,平板計(jì)數(shù)得嗜熱鏈球菌WHH3379凍干菌粉活菌數(shù)為1.3×1011 CFU/g,達(dá)到發(fā)酵劑的活性要求。利用DVS發(fā)酵7 h得到的酸乳pH值為(4.42±0.15),酸度為(75.00±2.34)°T,拉絲長(zhǎng)度可達(dá)(28.85±1.24)cm,黏度為(5 486±2.25)mPa·s和活菌數(shù)為1.89×108 CFU/mL(表2)。該發(fā)酵劑生產(chǎn)的發(fā)酵乳酸度適宜、產(chǎn)黏性好、感官評(píng)價(jià)高且后酸化現(xiàn)象不明顯(圖9),可作為一種功能性DVS應(yīng)用于發(fā)酵食品中。

表2 WHH3379的發(fā)酵乳特性

Table 2 Characteristics of milk fermented by WHH3379 DVS

圖9 WHH3379發(fā)酵乳產(chǎn)酸曲線

Fig.9 Acid production curve in WHH3379 fermented milk

3 討論

乳酸菌EPS可作為穩(wěn)定劑和增稠劑應(yīng)用于乳品行業(yè),起到改善乳制品質(zhì)構(gòu)和口感的作用,此外還具有抗氧化、抗腫瘤、增強(qiáng)免疫力及調(diào)節(jié)腸道菌群等多種益生功能[12]。EPS產(chǎn)量受到菌株類型、培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基成分等因素的影響[11]。根據(jù)EPS產(chǎn)量可以將乳酸菌分為高產(chǎn)(≥180 mg/L)、中產(chǎn)(120～180 mg/L)和低產(chǎn)(<120 mg/L)EPS菌株[27]。本研究得到的嗜熱鏈球菌WHH3379利用脫脂乳基料發(fā)酵得到的EPS產(chǎn)量為(526.58±2.91)mg/L,說明嗜熱鏈球菌WHH3379是1株高產(chǎn)EPS的乳酸菌。

乳酸菌EPS在抗氧化方面的巨大潛力,使其可以作為一種安全、有效、無毒和來源廣泛的天然抗氧化劑。其體外抗氧化功能主要通過清除體內(nèi)各種自由基來實(shí)現(xiàn),體內(nèi)抗氧化功能主要通過提高機(jī)體抗氧化酶活性和增強(qiáng)機(jī)體抗脂質(zhì)過氧化的作用來完成[28]。本研究中,嗜熱鏈球菌WHH3379的EPS質(zhì)量濃度在8 mg/mL時(shí),對(duì)DPPH自由基、·OH和的清除率分別為(79.9±2.26)%、(73.6±1.58)%和(61.0±1.38)%,總還原力為(1.213±0.88),具有較好的抗氧化功能。

發(fā)酵乳具備的營(yíng)養(yǎng)和益生功能越來越受到消費(fèi)者的青睞,其市場(chǎng)需求量的增加也對(duì)相應(yīng)發(fā)酵劑的穩(wěn)定性和功能性提出要求。優(yōu)良的發(fā)酵劑應(yīng)該具有產(chǎn)酸快、產(chǎn)黏高、后酸化穩(wěn)定和活菌數(shù)高等特點(diǎn)。本研究中由嗜熱鏈球菌WHH3379制備的DVS得到的發(fā)酵乳黏度高,組織狀態(tài)好,后酸化平緩,拉絲長(zhǎng)度為(28.85±1.24)cm,黏度為(5 486±2.25)mPa·s,酸度為(75.00±2.34)°T和活菌數(shù)為1.89×108 CFU/mL,同時(shí)嗜熱鏈球菌WHH3379 EPS又具有抗氧化功能,可作為一種功能性DVS應(yīng)用于發(fā)酵食品中。

4 結(jié)論

本研究從青海農(nóng)家自制酥油樣品中分離得到1株高產(chǎn)EPS乳酸菌,經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定、生理生化實(shí)驗(yàn)和分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn),鑒定該菌株為S.thermophilus,命名為嗜熱鏈球菌WHH3379,微生物保藏編號(hào)為CGMCC No.20089。以嗜熱鏈球菌WHH3379為出發(fā)菌株利用脫脂乳基料發(fā)酵,EPS產(chǎn)量為(526.58±2.91)mg/L。研究發(fā)現(xiàn)嗜熱鏈球菌WHH3379具有良好的耐酸耐膽鹽特性,且其產(chǎn)EPS具有良好的抗氧化活性。此外,由嗜熱鏈球菌WHH3379制得的DVS具有優(yōu)良的發(fā)酵特性,得到的發(fā)酵乳黏性高、質(zhì)構(gòu)細(xì)膩。因此,嗜熱鏈球菌WHH3379作為高產(chǎn)EPS并具有益生功能的乳酸菌發(fā)酵劑具有廣闊的工業(yè)應(yīng)用前景。