基于礦物元素技術(shù)的品種、產(chǎn)區(qū)葡萄酒的判別分析

寧夏賀蘭山東麓葡萄酒產(chǎn)區(qū)自2003年被國家列為“國家地理標志產(chǎn)品保護區(qū)”以來，所釀葡萄酒在國際上屢次獲獎，已成為中國葡萄酒的代表性產(chǎn)區(qū)。葡萄酒的商業(yè)價值主要來源于產(chǎn)地和葡萄酒釀造生產(chǎn)的年份[1]，因此，有些不法商販為了牟取利益，通過偽造地理標簽的方式誤導消費者，從而損害了消費者的利益，給品牌競爭帶來信任危機。我國葡萄酒產(chǎn)業(yè)起步較晚，對于產(chǎn)區(qū)、品種葡萄酒的鑒別，手段更是匱乏，故葡萄酒市場比較混亂，亟需可靠、實用的葡萄酒原產(chǎn)地溯源技術(shù)和判別方法[2-3]。

農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)地溯源主要是分析表征不同地域來源農(nóng)產(chǎn)品的特異性指標，目前主要采用質(zhì)譜、光譜和分子生物學等技術(shù)，通過分析農(nóng)產(chǎn)品的礦物元素、揮發(fā)性成分、同位素含量與比率、DNA圖譜等特征成分或指標，結(jié)合化學計量法，建立區(qū)分農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)地來源的特征指紋圖譜，從而對不同種類農(nóng)產(chǎn)品進行產(chǎn)地溯源[4]。在影響農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)的自然條件因素中，原產(chǎn)地土壤環(huán)境的差異使其在很大程度上產(chǎn)生了獨有的特點與個性[5]，因此，礦物元素分析技術(shù)被認為是植源性食品產(chǎn)地判別較為有效的方法[6-7]，已被廣泛應用[8]，例如枸杞[9]、中藥材粉葛[10]、新疆紅棗[11]、茶葉[12-14]等的產(chǎn)地溯源，均取得了良好的判別效果。

本研究以寧夏賀蘭山東麓不同品種(霞多麗、美樂、蛇龍珠、馬瑟蘭、赤霞珠、黑比諾)葡萄酒和我國不同產(chǎn)區(qū)(賀蘭山東麓、武威產(chǎn)區(qū)和沙城產(chǎn)區(qū))赤霞珠葡萄酒為研究對象，采用電感耦合等離子體質(zhì)譜技術(shù)，分析葡萄酒中Ag、Al、As、Ba、Be、Bi等58種礦質(zhì)元素，研究礦質(zhì)元素在品種和產(chǎn)地葡萄酒判別中的可行性，研究成果可為葡萄酒品種、產(chǎn)地溯源提供科學方法和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗標準溶液選用美國Perkin Elmer公司的4組57種混合標準溶液(Ag、Al、As、Ba、Be、Bi、Ca、Cd、Co、Cr、Cs、Cu、Fe、Ga、Li、Mg、Mn、Na、Ni、Rb、Se、Sr、Tl、U、Zn；Au、Hf、Ir、Pd、Pt、Ru、Sb、Sn；B、Ge、Mo、Nb、P、Re、Ta、Ti、W、Zr；Ce、Er、Eu、Gd、Ho、Nd、Pr、Sc、Sm、Tb、Th、Tm、Y、Yb)和中國計量科學研究院的汞單元素標準溶液(Hg)，共計58種元素；質(zhì)控樣品選用生物成分分析標準物質(zhì)胡蘿卜(GBW 10047)，中國地質(zhì)科學院地球物理地球化學勘查研究所；硝酸、鹽酸(優(yōu)級純)，國藥集團；水為實驗室一級用水。

1.2 儀器與設(shè)備

ELAN DRC-e型電感耦合等離子體質(zhì)譜儀(inductively coupled plasma mass spectrometry,ICP-MS)，美國Perkin Elmer公司；Mars6 Xpress微波消解儀，美國CEM公司；AL104型電子天平，梅特勒-托利多。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品采集

供試葡萄酒采集自寧夏(銀川、青銅峽、紅寺堡等)(n=54)，涉及6個釀酒葡萄品種，包括霞多麗(n=9)、美樂(n=9)、蛇龍珠(n=6)、馬瑟蘭(n=11)、赤霞珠(n=9)和黑比諾(n=10);甘肅(n=6);河北(n=4)。其中甘肅的1個葡萄酒樣本及河北的4個葡萄酒樣本為多品種釀酒葡萄混合釀制的葡萄酒，不納入品種間元素差異分析，樣本采集時間為2020年。

1.3.2 樣品前處理

葡萄酒樣品先揮發(fā)乙醇，采用微波消解法消解，具體操作步驟：量取5.00 mL葡萄酒樣品于微波消解管中，置于趕酸儀上120 ℃揮干乙醇，待冷卻后加入硝酸10 mL，常溫靜置預消解3～4 h后，隨后置于微波消解儀中進行消解。選擇溫度控制，10 min爬升至120 ℃，保持10 min；10 min爬升至150 ℃，保持20 min；10 min爬升至180 ℃，保持30 min，消解完畢完全冷卻后，去掉蓋子，置于趕酸儀上120 ℃趕酸3 h，然后冷卻至室溫，用水完全轉(zhuǎn)移至25.0 mL刻度試管中，定容至刻度，混勻；同時做試劑空白。

1.3.3 礦物元素含量測定

電感耦合等離子體質(zhì)譜儀測定元素采用標準模式。優(yōu)化后的工作條件為：發(fā)生器功率：1 300 W；檢測器模擬階電壓：-2 350 V；離子透鏡電壓：6.00 V；霧化器流量：0.98 L/min；等離子炬冷卻氣流量：17.0 L/min；輔助器流量：1.20 L/min。上機測定葡萄酒樣品及GBW 10047中58種元素，GBW 10047的各元素測定結(jié)果均在標準參考值范圍內(nèi)。各元素標準曲線相關(guān)系數(shù)均>0.99，檢出限為0.000 1 μg/L～3.66 mg/L(各元素測定的標準曲線、檢出限和定量限見附表1，https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1802.TS.20211106.1444.002.html)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

每個葡萄酒樣本平行2次測定，平行測定結(jié)果的相對相差<10%的平均值作為最后結(jié)果進行數(shù)據(jù)處理分析。采用SPSS 25.0軟件進行單因素方差、主成分分析和Fisher判別分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 賀蘭山東麓產(chǎn)區(qū)不同品種葡萄酒中礦物元素含量差異分析

由表1可知，葡萄酒中58種礦物元素均有檢出，且含量差異較大。Mg元素含量最高(>100 mg/L)Na、P含量為10～100 mg/L，Al、B、Ca、Mn、Fe、Sr元素含量為1～10 mg/L，其次為Ce、Cr、Cu、Rb、Ti、Zn元素，(<1 mg/L)，其余元素含量均處于μg/L級。

通過對霞多麗、美樂、蛇龍珠、馬瑟蘭、赤霞珠和黑比諾6個單品葡萄酒中58種元素含量進行方差分析。其中As、B、Ba、Be、Cd、Co、Cr、Cu、Er、Gd、Hg、Li、Mo、Na、Nb、Ni、Sb、Sn、Sr、Tb、Ti、Th、Tl、Tm、U、Y、Yb、Fe、W、Hf、Pd、Ga、Zr、Re、Ca 35種元素含量在6個品種間存在顯著差異(P<0.05)，元素Al、Bi、Ce、Cs、Eu、Ge、Ho、Mg、Mn、Nd、Pr、Rb、Sc、Se、Sm、Zn、P、Ru、Au、Ta、Ir、Pt、Ag 23種元素含量在品種間差異不顯著(P>0.05)(表1)。霞多麗釀制的葡萄酒中Be、Er、Gd、Nb、Tb、Tl、Tm、Y、Yb、Hf、Pd、Zr、Ca 13種元素含量明顯高于其他品種，而Cr、Cu、Ni、Sn、Sr、Fe、Ga、Re 8種元素含量低于其他品種；美樂釀制的葡萄酒中Cr、Cu和Re元素高于其他品種，As、Be、Ba、Co、Er、Gd、Hg、Li、Mo、Nb、W、Tb、Tl、Tm、Y、Yb、Pd 17種元素低于其他品種；蛇龍珠釀制的葡萄酒中As、Ba、Cd、Co、Na、U、W 7種元素含量明顯高于其他品種釀制的葡萄酒；馬瑟蘭釀制的葡萄酒中B和Mo元素高于其他品種，Cd、Na、Hf、Zr低于其他品種；赤霞珠釀制的葡萄酒中Hg、Li、Ni、Sb、Sn、Sr、Ga、Fe 8種元素高于其他品種；黑比諾釀制的葡萄酒中B、Ca元素低于其他品種。寧夏種植的不同品種的釀酒葡萄釀制的葡萄酒中礦物元素含量有其各自的特征，礦物元素在不同品種之間具有較大的差異性。

2.2 葡萄酒中礦物元素的主成分分析

主成分分析技術(shù)是重要的指紋分析技術(shù)之一，它將多項指標重新組合成一組新的互相無關(guān)的幾個綜合指標，能夠用較少指標反應較多信息的一種無監(jiān)督分析方法[15-21]。本研究對寧夏產(chǎn)區(qū)不同品種葡萄酒存在顯著差異的35種礦物元素進行主成分分析，KMO統(tǒng)計量為0.646(>0.5)，各元素之間具有顯著相關(guān)性，可以進行主成分分析，結(jié)果見表2(詳見附表2,https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1802.TS.20211106.1444.002.html)。第1主成分方差貢獻率為28.645%，綜合了Er、Y、Tb、Tm、Yb、Gd、Pd、Hf、Zr、Th 10種元素信息，這些元素均為堿金屬和過渡金屬；第2主成分方差貢獻率為14.325%，綜合了Sb、Na元素信息；第3主成分方差貢獻率為7.401%，綜合了Ni、Cr元素信息；第4主成分方差貢獻率為6.658%，代表了Ba、Be、Ga元素信息；第5主成分方差貢獻率為4.790%，代表了Re、Sr元素信息；第6主成分方差貢獻率為4.559%，綜合了Li、Sn元素信息；第7主成分方差貢獻率為3.916%，代表了Mo元素信息；第8主成分方差貢獻率為3.820%，代表了B元素信息；第9主成分方差貢獻率為3.586%，代表了Cu元素信息；第10主成分方差貢獻率為 2.940%，代表了Ca元素信息；前10個主成分累計方差貢獻率為80.640%。篩選出Er、Y、Tb、Tm、Yb、Gd、Pd、Hf、Zr、Th、Sb、Na、Ni、Cr、Ba、Be、Ga、Re、Sr、Li、Sn、Mo、B、Cu、Ca 25種葡萄酒的特征礦物元素。

表1 不同品種釀酒葡萄釀制葡萄酒中礦物元素含量
Table 1 Content of mineral elements in wine made from different grape varieties

續(xù)表1

注：元素*表示元素質(zhì)量濃度單位為μg/L，未標*的表示元素質(zhì)量濃度單位為mg/L；表中數(shù)據(jù)均為平均值±標準差；同行不同的小寫字母表示差異顯著(P<0.05)

表2 前10個主成分的載荷矩陣及方差貢獻率
Table 2 Load matrix and variance contribution rate of the first 10 principal components

2.3 不同品種葡萄酒的判別分析

礦物元素含量的差異揭示了不同品種釀酒葡萄釀制的葡萄酒存在差異，但不足以對不同品種葡萄酒進行準確判別，為了驗證品種是否影響產(chǎn)地判別，采用Fisher判別分析法對寧夏賀蘭山東麓產(chǎn)區(qū)6個品種釀酒葡萄釀制的葡萄酒進行品種判別。

建立基于Fisher判別函數(shù)的一般判別方法對葡萄酒樣本進行多變量判別分析，以58種礦物元素作為判別分析的自變量，進行逐步判別分析。結(jié)果顯示，Al、As、B、Ba 等40種對品種判別顯著的元素被引入到判別模型中。不同品種葡萄酒判別函數(shù)模型系數(shù)見表3，判別分類結(jié)果見表4。提取模型前5個典型判別函數(shù)，Willks′ Lambda檢驗結(jié)果進一步證實，在α=0.05的顯著性水平下，5個函數(shù)對分類效果均為顯著，其中判別函數(shù)1和判別函數(shù)2累積解釋判別模型能力為73.2%，且相關(guān)系數(shù)均>0.92，表明判別函數(shù)1和判別函數(shù)2對6個葡萄酒品種分類占主要貢獻作用，利用判別函數(shù)1和判別函數(shù)2的得分值作散點圖。如圖1所示，霞多麗、黑比諾、馬瑟蘭3個品種容易區(qū)分，并分別位于不同空間，赤霞珠、美樂和蛇龍珠3個品種樣本有部分重疊。分類結(jié)果表明：回代檢驗的整體正確判別率分別為100%，回代檢驗是針對所有訓練樣本進行的檢驗，樣品的錯判率是相應總體率的偏低估計，而交叉檢驗比較真實地體現(xiàn)了模型的判別能力[22]，交叉檢驗整體正確判別率僅為38.9%，每個品種均有大部分樣本被誤判，說明基于礦物元素的差異不能有效鑒別不同品種的葡萄酒。

圖1 不同品種葡萄酒前2個典型判別函數(shù)得分散點圖
Fig.1 Scattering points of the first two typical discrimination functions of wines from different varity

表3 不同品種釀酒葡萄釀制的葡萄酒判別函數(shù)模型系數(shù)
Table 3 Wine discriminant function model coefficients of different varieties of wine grapes

2.4 不同產(chǎn)地葡萄酒的判別分析

為了驗證礦物元素分析技術(shù)對葡萄酒產(chǎn)地判別的可行性，建立基于Fisher判別函數(shù)的一般判別方法對寧夏賀蘭山東麓、甘肅武威、河北沙城產(chǎn)區(qū)葡萄酒樣本進行多變量判別分析，以58種礦物元素作為判別分析的自變量，進行逐步判別分析，結(jié)果顯示，Al、B、Cs、Na、Rb、Sr、Ti、Fe、Zn、Pt、Re 11種對產(chǎn)地判別顯著的元素被引入到判別模型中。不同產(chǎn)地葡萄酒判別函數(shù)模型系數(shù)見表5，判別分類結(jié)果見表6。提取模型前2個典型判別函數(shù)對分類效果均為顯著，利用判別函數(shù)1和判別函數(shù)2的得分值作散點圖，如圖2所示，寧夏賀蘭山東麓、河北沙城、甘肅武威3個產(chǎn)地容易區(qū)分，并分別位于不同空間。分類結(jié)果表明：回代檢驗和交叉檢驗的整體正確判別率分別為100%和98.4%，說明基于礦物元素指紋的差異可有效鑒別不同產(chǎn)地的葡萄酒。

表4 不同品種釀酒葡萄葡萄酒的一般判別分析結(jié)果
Table 4 Results of general discriminant analysis of different varieties of wine grape wine

表5 不同產(chǎn)地葡萄酒判別函數(shù)模型系數(shù)
Table 5 Coefficient of discriminant function model for wines from different provenances

表6 不同產(chǎn)地葡萄酒的一般判別分析結(jié)果
Table 6 Results of general discriminant analysis of wines from different regions

圖2 不同產(chǎn)地葡萄酒前2個典型判別函數(shù)得分散點圖
Fig.2 The scatter points of the first two typical discriminant functions were obtained

3 結(jié)論

通過分析寧夏賀蘭山東麓產(chǎn)區(qū)的霞多麗、美樂、蛇龍珠、馬瑟蘭、赤霞珠、黑比諾6個單品葡萄酒中58種礦物元素含量及組成特征，明確了As、B、Ba、Be、Cd、Co、Cr、Cu、Er、Gd、Hg、Li、Mo、Na、Nb、Ni、Sb、Sn、Sr、Tb、Ti、Th、Tl、Tm、U、Y、Yb、Fe、W、Hf、Pd、Ga、Zr、Re、Ca 35種元素含量存在顯著差異(P<0.05)。通過主成分分析確定了Er、Y、Tb、Tm、Yb、Gd、Pd、Hf、Zr、Th、Sb、Na、Ni、Cr、Ba、Be、Ga、Re、Sr、Li、Sn、Mo、B、Cu、Ca 25品種葡萄酒的特征礦物元素。Fisher判別分析確定了Cd、Ce、Co、Cu、Gd、Hg、Mg、Se、Zn、P 10種葡萄酒的有效溯源指標。Fisher判別分析方法構(gòu)建的判別模型的回代檢驗的整體正確判別率為97.3%，但是交叉檢驗的整體正確判別率僅為35.6%，故基于礦物元素的差異不能有效鑒別不同品種的葡萄酒。

通過基于Fisher判別函數(shù)的一般判別方法對寧夏賀蘭山東麓產(chǎn)區(qū)、甘肅武威產(chǎn)區(qū)和河北沙城產(chǎn)區(qū)葡萄酒樣本中58種礦質(zhì)元素進行多變量判別分析顯示，Al、B、Cs、Na、Rb、Sr、Ti、Fe、Zn、Pt、Re 11種對產(chǎn)地判別顯著的元素被引入到判別模型中，回代檢驗和的交叉檢驗整體正確判別率分別為100%和98.4%，說明基于礦物元素指紋的差異可有效鑒別不同產(chǎn)地的葡萄酒。

綜合以上分析，礦物元素技術(shù)結(jié)合多元統(tǒng)計分析方法對產(chǎn)地葡萄酒的判別有效可行，建立的基于Fisher判別模型可用于葡萄酒原產(chǎn)地的識別，對地理標志產(chǎn)品葡萄酒及消費者合法權(quán)益的保護提供了有效的技術(shù)支撐。