濃香型白酒酒醅發(fā)酵過程中風(fēng)味物質(zhì)時空差異分析

中國白酒主要分為十二大香型,較為典型的代表為濃香型。濃香型白酒以高粱、大米等糧谷物為釀造原料,以中高溫大曲為糖化發(fā)酵劑,原料與曲混合發(fā)酵形成酒醅,酒醅發(fā)酵后,取酒糟,經(jīng)過緩火蒸餾、儲存、勾兌等釀造工藝得到風(fēng)味豐富、口感獨(dú)特的濃香型白酒。白酒發(fā)酵過程中,風(fēng)味微生物以酒醅為載體參與白酒釀造的糖化、產(chǎn)酒以及生香過程,進(jìn)而影響成品酒的酒質(zhì)[1-3]。近年來,酒醅的理化參數(shù)、微生物群落演替以及酒醅中揮發(fā)性香氣成分受到研究者的關(guān)注[4-5]。任劍波等[6]通過對窖池不同層面酒醅中微生物的研究發(fā)現(xiàn),酒醅微生物區(qū)系存在差異；李賀賀等[7]分析了古井貢酒酒醅中的風(fēng)味物質(zhì),共定性出148種揮發(fā)性香氣成分。隨著固相微萃取技術(shù)在食品發(fā)酵領(lǐng)域的普及,酒醅中揮發(fā)性香氣成分的研究愈加廣泛,而針對酒醅風(fēng)味成分變化的時空差異研究有待進(jìn)一步完善。

本研究以濃香型酒醅作為研究對象,通過頂空固相微萃取-氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法(headspace solid phase microextraction-GC-MS,HS-SPME-GC-MS)定性、定量分析酒醅不同空間層中的主要呈香物質(zhì),通過主成分分析探究影響酒醅的主要風(fēng)味成分,并對其重要呈香物質(zhì)及其前體物的時空遷移規(guī)律進(jìn)行跟蹤監(jiān)測,以期為濃香型白酒酒醅發(fā)酵過程與白酒風(fēng)味的聯(lián)系提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

酒醅樣品,取自川南某濃香型白酒廠。按窖池深度差異分為上、中、下3層,每層采用5點(diǎn)取樣法取樣,放入無菌袋密封,并置于4 ℃下保存,取回后樣品及時處理[8]。

1.1.2 試劑

2-辛醇、乙酸正戊酯、無水乙醇(均為色譜純)、NaCl(分析純),成都市科龍化工試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

AR2140電子天平,梅特勒托利多儀器有限公司；7890A—5975B氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀,美國 Agilent 公司；KQ5200E超聲波清洗儀,昆山市超聲儀器有限公司；ZHBF-RE旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀,中環(huán)北方有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

采用HS-SPME-GC-MS,對濃香型白酒酒醅的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行分析。

1.3.1 樣品前處理

稱取酒醅樣品10 g,加入50 mL無水乙醇20 ℃超聲處理15 min,取浸提液進(jìn)行蒸餾濃縮,蒸餾液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)再次濃縮至20 mL,最后使用氮吹濃縮至5 mL備用[9-10]。

1.3.2 HS-SPME-GC-MS測定條件

萃取條件：取氮吹后的濃縮液5 mL于頂空進(jìn)樣瓶。頂空進(jìn)樣樣品中加入100 μL內(nèi)標(biāo)溶液,將進(jìn)樣瓶密封,于50 ℃恒溫平衡樣品20 min,同時使用老化后的50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭萃取40 min,手動進(jìn)樣分析。

色譜條件：DB-WAX(60.0 m×0.25 mm×0.25 μm)毛細(xì)管色譜柱；載氣為99.999%氦氣,進(jìn)樣口溫度230 ℃；分流比20∶1；程序升溫為初始溫度40 ℃,保持1 min,7 ℃/min升到180 ℃,保持3 min；10 ℃/min升到230 ℃,保持3 min；載氣流速1 mL/min。

質(zhì)譜條件：電離電壓70 eV,離子源溫度230 ℃,四極桿溫度150 ℃,電離方式為電子電離(electron ionization,EI),質(zhì)譜掃描范圍20～500 amu,溶劑延遲3 min。

定性分析：采用NIST05a.L標(biāo)準(zhǔn)譜庫(美國 Agilent 公司)比對,通過GC-MS化學(xué)工作站進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

定量分析：采用內(nèi)標(biāo)法,使用2-辛醇、乙酸正戊酯為內(nèi)標(biāo)物,通過預(yù)試驗(yàn)調(diào)整內(nèi)標(biāo)物濃度,確定2-辛醇質(zhì)量濃度為16.944 7 mg/mL,乙酸正戊酯質(zhì)量濃度為0.527 5 mg/mL,以2-辛醇內(nèi)標(biāo)檢測酒醅中含量較多的風(fēng)味物質(zhì),以乙酸正戊酯檢測酒醅中含量較低的風(fēng)味物質(zhì)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

設(shè)置3組平行,每組樣品測定3次,結(jié)果采用(x±S)表示,采用SPSS 22.0數(shù)據(jù)分析軟件和NIST 8.0譜庫檢索,對呈香物質(zhì)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 酒醅不同空間層的風(fēng)味差異分析

酒醅的風(fēng)味直接決定了濃香型白酒口感質(zhì)量,原料的發(fā)酵方式?jīng)Q定了濃香型白酒窖香濃郁、綿甜爽凈、回味悠長的酒質(zhì)特點(diǎn)[11]。本試驗(yàn)通過頂空固相微萃取處理樣品,對酒醅中主要酯類[12]、醇類[13]、酸類以及白酒有益風(fēng)味因子進(jìn)行分析,結(jié)果見表1。

表1 酒醅不同層面主要風(fēng)味物質(zhì)分析結(jié)果

Table 1 Analysis results of main flavor compounds in different layers of fermented grains

注：-表示未檢出；酒醅不同層共有物質(zhì)相對含量差異顯著用不同大寫字母表示(P<0.05),含量差異顯著用不同小寫字母表示(P<0.05)

本試驗(yàn)針對酒醅中含量較高的醇類、酯類、酸類和酚類物質(zhì)進(jìn)行檢測,共有38種物質(zhì),其中酯類18種、醇類10種、酸類8種和4-甲基愈創(chuàng)木酚、4-乙基愈創(chuàng)木酚2種白酒有益因子。

酒醅不同層均所檢測到的物質(zhì)分別有四大酯(己酸乙酯、丁酸乙酯、乙酸乙酯、乳酸乙酯)、四大酸(己酸、丁酸、乙酸、乳酸)和戊酸乙酯、庚酸乙酯、辛酸乙酯、十六酸乙酯、異戊醇、正戊酸、4-甲基愈創(chuàng)木酚、4-乙基愈創(chuàng)木酚等物質(zhì),這些風(fēng)味物質(zhì)對濃香型白酒的整體風(fēng)味具有較大影響。酒醅上、中、下層主要呈香物質(zhì)分別為20、32、26種,其中上、中、下層主要酯類數(shù)量分別為7、18、14種,主要醇類數(shù)量分別為7、8、5種,主要酸類數(shù)量分別為4、8、7種,以及共有的酚類物質(zhì)各2種。

醇類物質(zhì)在酒醅上、中、下層相對含量分別為1.98%、10.62%、1.13%,具體含量分別為18.54、354.70、26.14 mg/L,醇類物質(zhì)突出表現(xiàn)在中層酒醅中,包括苯乙醇、十二醇、六聚乙二醇等高級醇成分,高級醇是酒類中最主要的香味和口味物質(zhì)之一,適量的含量能使酒香味和口味協(xié)調(diào)、豐滿,高級醇具有強(qiáng)烈的甜香、奶香[14-15],有學(xué)者提出,苯乙醇是玫瑰香葡萄酒的特征香氣成分,具有清甜的玫瑰樣花香,可增加酒體香味,使成品酒余味回香[16-17]。

酸類物質(zhì)在酒醅上、中、下層相對含量分別為50.88%、43.27%、55.80%,具體含量分別為476.54、1 444.75、1 293.41 mg/L,酸類物質(zhì)在酒醅上層風(fēng)味中占比低于酸在中、下層中的占比,而實(shí)際含量卻高于中層和下層,綜合得出,酒醅中層無論是主要風(fēng)味成分種類還是在總含量上皆更為豐富,而上層則表現(xiàn)得略為單調(diào),酒醅下層中己酸及己酸乙酯含量最高,分別達(dá)220.25和441.86 mg/L,下層酒醅厭氧程度更高,更有利于己酸菌等厭氧菌在下層酒醅中代謝產(chǎn)生己酸及進(jìn)一步合成濃香型白酒的主體風(fēng)味物質(zhì)己酸乙酯。

酯類物質(zhì)在酒醅上、中、下層相對含量分別為46.89%、45.81%、42.79%,具體含量分別為439.17、1 529.45、989.89 mg/L,作為白酒主體風(fēng)味骨架的四大酯、四大酸在酒醅不同空間層面均有所分布,其中酒醅上、中、下層中四大酯相對含量占總酯69.65%、56.23%、66.79%,在酯類物質(zhì)中占有絕對的主導(dǎo)地位,丁酸乙酯與己酸乙酯相對含量比值分別為0.07、0.15、0.14,有學(xué)者認(rèn)為,四大酯占總酯比例較大,則酒質(zhì)好,濃香型風(fēng)格突出；丁酸乙酯與己酸乙酯比值低于0.1,則酒體協(xié)調(diào),從這個角度分析,上層酒醅對白酒濃香型風(fēng)格的形成和對整個酒體的品質(zhì)貢獻(xiàn)較大[18-19]。

此外,本研究也對愈創(chuàng)木酚等白酒有益風(fēng)味因子進(jìn)行了檢測。酒醅不同空間層均檢測到了4-甲基愈創(chuàng)木酚和4-乙基愈創(chuàng)木酚,酒醅中層含量略高,4-甲基愈創(chuàng)木酚和4-乙基愈創(chuàng)木酚含量約為5.01 mg/L,4-甲基愈創(chuàng)木酚、4-乙基愈創(chuàng)木酚具有呈香、呈味作用,在醬、濃、清、芝麻香等最具白酒代表的四大香型白酒研究中均有報道,具有普遍性,愈創(chuàng)木酚是白酒中的有益因子,具有較好的抗氧化、抗腫瘤和增強(qiáng)人體免疫力的作用[20-21]。

對酒醅上層、中層以及下層所檢出的38種風(fēng)味成分進(jìn)行主成分分析作降維處理,以得到對酒醅影響較大的主要呈香物質(zhì),進(jìn)而分析其發(fā)酵過程變化規(guī)律,分析結(jié)果見圖1。

a-載荷散點(diǎn)圖；b-重要風(fēng)味物質(zhì)

圖1 酒醅風(fēng)味主成分分析結(jié)果

Fig.1 PCA results of fermented grains flavor

變量的載荷系數(shù)反映了變量對各主成分的影響程度,載荷系數(shù)絕對值越大,則該變量對主成分的貢獻(xiàn)也越大[22]。由圖1-a可知,第一主成分(PC1)單獨(dú)貢獻(xiàn)率為91.90%,第二主成分(PC2)單獨(dú)貢獻(xiàn)率為6.56%,兩者累計貢獻(xiàn)率為98.46%(>85.00%),具有代表意義。圖1-b為第一主成分和第二主成分綜合分析結(jié)果,得到酒醅的重要風(fēng)味物質(zhì),其代表有乙酸乙酯、丁酸乙酯、戊酸乙酯、己酸乙酯、乳酸乙酯、辛酸乙酯、己酸己酯、丁酸、己酸、乳酸、乙酸等。

綜合上述結(jié)果,決定對乳酸乙酯、己酸乙酯、丁酸乙酯、乙酸乙酯及其前體酸的時空變化規(guī)律作進(jìn)一步跟蹤監(jiān)測。

2.2 發(fā)酵過程酒醅風(fēng)味成分變化規(guī)律反映的結(jié)果

酒醅不同層面的發(fā)酵過程受窖內(nèi)溫度、厭氧環(huán)境、微生物群落等眾多因素影響,反映結(jié)果為酒醅的風(fēng)味物質(zhì)隨發(fā)酵時間變化存在差異[23-24]。本試驗(yàn)監(jiān)測了濃香型不同層面的酒醅發(fā)酵過程重要風(fēng)味物質(zhì)及其前體物(四大酯、四大酸)含量的變化,其結(jié)果如圖2、圖3所示。酒醅不同空間層重要呈香物質(zhì)隨時間變化存在差異,酒醅不同空間層的四大酯、四大酸整體上先增加較緩(0～15 d),中后期迅速增加至穩(wěn)定趨勢,其中,酒醅的中、下層變化較大,上層變化趨勢較緩。

a-己酸乙酯；b-丁酸乙酯；c-乙酸乙酯；d-乳酸乙酯

圖2 酒醅重要酯類物質(zhì)含量變化結(jié)果

Fig.2 Content changes of important esters in fermented grains

a-己酸；b-丁酸；c-乙酸；d-乳酸

圖3 酒醅重要酯類前體物質(zhì)含量變化結(jié)果

Fig.3 Content changes of important ester precursors in fermented grains

發(fā)酵0～15 d,酒醅中己酸乙酯含量增加緩慢,15 d后中、下層己酸乙酯含量迅速增加,發(fā)酵進(jìn)行到50 d后,增加趨勢放緩,酒醅上層較酒醅中下層相比,增加趨勢和中、下層相近,但增加程度明顯低于中、下層,發(fā)酵到63 d時,上層己酸乙酯含量為59.25 mg/L,中、下層質(zhì)量濃度分別為136.77和162.77 mg/L。酒醅中、下層在發(fā)酵前期乙酸乙酯含量大致趨于一致,隨后上、下層含量增加趨勢放緩,趨于穩(wěn)定,直至發(fā)酵后期,而中層乙酸乙酯含量繼續(xù)增加,至35 d達(dá)到峰值,為82.79 mg/L,隨后有所降低,發(fā)酵進(jìn)行到50 d后趨于穩(wěn)定。整體上,丁酸乙酯在同一發(fā)酵過程在四大酯含量中最少,丁酸乙酯的生成和己酸乙酯的生成在前63 d呈正相關(guān),63 d后,下層中的丁酸乙酯含量有所降低。在發(fā)酵中期,乳酸乙酯含量處于較快的增加水平,35 d后,中、下層增加趨勢放緩,而上層酒醅在35～56 d乳酸乙酯含量迅速增加,隨后呈明顯下降趨勢。發(fā)酵初期,酒醅內(nèi)微生物主要起糖化作用,所需的碳源和能源物質(zhì)需要不斷補(bǔ)充,此時酯主要起分解作用,酯類合成較少。沈怡方[25]認(rèn)為,酯的形成有3條途徑：一是酵母菌在酒精發(fā)酵時的副產(chǎn)物；二是酒醅中過量的酸經(jīng)微生物酯化形成；三是其他微生物發(fā)酵的代謝物。因此發(fā)酵前期(0～15 d),窖內(nèi)酒精含量較低,發(fā)酵中期微生物主要起產(chǎn)酒的作用,且酸類物質(zhì)含量也較低,故酒醅中酯的生成量較少,酯類的生成較緩,到發(fā)酵中后期,發(fā)酵進(jìn)入產(chǎn)酯階段,微生物代謝產(chǎn)物增多,醇類以及乙酸、丁酸等合成己酸乙酯、丁酸乙酯等的前體物質(zhì)大量增多,酯類物質(zhì)開始大量生成,為白酒發(fā)酵過程提供“產(chǎn)香”作用。

酒醅不同空間層中,隨發(fā)酵時間增加，酒醅上層己酸的含量增加明顯,63 d時達(dá)到峰值,最高達(dá)366.70 mg/L和上、中層存在明顯差異,上層己酸含量在前45 d左右略高于中層,隨后下層己酸含量開始降低至平緩,中層繼續(xù)增加至發(fā)酵后期趨于穩(wěn)定,酒醅中層的乙酸、乳酸、丁酸含量進(jìn)入主發(fā)酵期后,在不同發(fā)酵時間段,其三大酸含量皆高于上層和下層,其乙酸、乳酸含量分別在49 d和63 d達(dá)到峰值,分別為266.55、665.51 mg/L。有機(jī)酸的生成受到產(chǎn)酸微生物生理活動影響,隨發(fā)酵時間的進(jìn)行,環(huán)境對產(chǎn)酸微生物表征為協(xié)同作用,有利于產(chǎn)酸微生物的代謝活動,促使有機(jī)酸含量上升,并進(jìn)一步促使酯類合成[26-27]。窖內(nèi)微生物群落主要為乳酸菌群,故酒醅中乳酸菌代謝所產(chǎn)生的乳酸含量及合成的乳酸乙酯含量較其他有機(jī)酸及酯類物質(zhì)高,窖內(nèi)中、下層厭氧程度更高,且黃水滲透中、下層,賦予了中、下層酒醅更多的營養(yǎng)物質(zhì),更加適于己酸菌、丁酸菌等厭氧菌群的代謝繁殖,合成的酯類最終也高于酒醅上層,而在發(fā)酵前45 d,上層酒醅己酸含量累計速度較中層略高,可能是由于發(fā)酵中期中層酒醅中己酸累計量還較低,己酸主要用于合成己酸乙酯,消耗了己酸,導(dǎo)致發(fā)酵前、中期酒醅中層己酸含量較低,后期己酸累計量增多,滿足己酸乙酯的合成需要,故累計量繼續(xù)增加,而上層酒醅中的己酸含量隨發(fā)酵的繼續(xù)進(jìn)行趨于平緩；發(fā)酵過程中,丁酸含量在四大酯中最低,可能有2種原因,一是產(chǎn)丁酸菌的繁殖代謝需要厭氧生態(tài)因子,生存條件相對苛刻;二是丁酸作為己酸代謝途徑的中間物,合成己酸消耗了丁酸,加上丁酸也被丁酸乙酯的合成所消耗,故含量處于較低水平。

3 結(jié)論

本研究采用HS-SPME-GC-MS法對濃香型白酒酒醅不同層面的主要風(fēng)味物質(zhì)和發(fā)酵過程四大酯、四大酸的變化規(guī)律進(jìn)行了分析。檢測分析了酒醅不同層面相對含量較高的風(fēng)味物質(zhì)38種,包括酯類物質(zhì)18種、醇類物質(zhì)10種、酸類物質(zhì)8種以及2種白酒有益因子愈創(chuàng)木酚。

酒醅上、中、下層的酯類數(shù)量分別為7、18、14種,醇類數(shù)量分別為7、8、5種,酸類數(shù)量分別為4、8、7種。酒醅上層的風(fēng)味物質(zhì)種類較少,但上層酒醅對白酒濃香型風(fēng)格的形成和對整個酒體的品質(zhì)貢獻(xiàn)較大；酒醅中層無論是主要風(fēng)味成分種類還是在總含量聚集了更為豐富的香氣成分；酒醅中、下層的酸和酯類物質(zhì)含量較高。

酒醅不同空間層的四大酯、四大酸整體上呈現(xiàn)先較緩增加(0～15 d),中后期呈迅速增加至穩(wěn)定的趨勢,其中,酒醅的中、下層變化趨勢較大,上層變化趨勢較緩。本研究解析了濃香型白酒發(fā)酵過程中酒醅不同層面的主要風(fēng)味物質(zhì)在時間層面和空間層面的變化規(guī)律,為進(jìn)一步研究固態(tài)發(fā)酵過程提供了理論依據(jù)。