藍點馬鮫魚分離蛋白滋味特性研究

魚分離蛋白(fish protein isolates,FPI)是通過蛋白等電點絮凝原理制備而得,該制備原理是先將肌肉蛋白溶于極性酸堿環(huán)境中,再調(diào)節(jié)溶液pH至等電點使蛋白質(zhì)沉淀,從而獲得分離蛋白。在極性酸堿條件下蛋白質(zhì)變性帶有大量同種電荷,從而增加靜電排斥,提高蛋白質(zhì)親水性可使之溶于極性酸堿溶液中[1]；當pH為5.0～6.0時,蛋白質(zhì)的同種電荷消失,疏水性增強,從而發(fā)生聚沉[2]。分離蛋白具有回收率高、消化率高[3]、蛋白含量高[4]、脂肪含量低[5]、腥味小、白度大以及凝膠特性優(yōu)良等優(yōu)點[6]。與漂洗魚糜相似之處是呈味物質(zhì)(游離氨基酸、呈味核苷酸、水溶性無機離子等)大多為水溶性,會在漂洗或pH變換過程中流失,造成滋味品質(zhì)的降低。與漂洗魚糜不同的是,分離蛋白制備過程中會引入大量的NaCl,Na+和Cl-對水產(chǎn)食品的滋味特性影響較大[7],FPI中Na+的增多會使魚糜特有的滋味特性改變。因此本研究通過測定藍點馬鮫魚漂洗魚糜和酸、堿分離蛋白呈味物質(zhì)變化,探討漂洗法、pH變換法對魚蛋白滋味特性的影響,為分離蛋白滋味改良提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

藍點馬鮫魚,購于上海市臨港新城蘆潮港海鮮市場,規(guī)格：體長(51.39±1.68)cm、質(zhì)量(683.75±116.62)g,冰鮮運輸至實驗室后立刻去頭、內(nèi)臟和鰭,采肉后于-40 ℃冷藏備用。

1.2 主要儀器及設(shè)備

均質(zhì)機,海標本模型廠；冷凍離心機,湖南湘儀有限公司；L-8800氨基酸全自動分析儀,日本Hitachi公司；W2690/5高效液相色譜儀,美國Waters公司；ASTREE電子舌,法國Alpha MOS公司；ZEEnit 700石墨爐原子吸收光譜儀,德國耶拿公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 藍點馬鮫魚蛋白的溶解和回收

以魚肉∶預冷去離子水=1∶9(g∶mL),混合均質(zhì)2 min,勻漿體積記為V,用考馬斯亮藍測得總蛋白濃度為C,然后用1 mol/L HCl溶液或NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至 1.5～13.0(pH相差0.5為1個梯度),離心(4 ℃、12 000×g、20 min),收集上清液并記錄體積V1,蛋白濃度為C1,上清液分別用1 mol/L NaOH溶液或 HCl溶液調(diào)節(jié)pH至等電點(5.0、5.5、6.0),離心(4 ℃、12 000×g、20 min),收集上清液并記錄體積V2,蛋白濃度為C2。溶解度、回收率計算分別如公式(1)、公式(2)所示：

蛋白質(zhì)溶解度

(1)

蛋白質(zhì)回收率

(2)

1.3.2 分離蛋白的制備

參照劉詩長等[8]的方法并修改,稱取2份碎魚肉60.0 g,分別與4 ℃超純水按照料液比1∶9(g∶mL)混合,均質(zhì)2 min,4 ℃靜置15 min,單層紗布過濾以去掉筋膜等肌基質(zhì)蛋白,1份用2 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)pH至2.5,另1份用2 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至12.5,離心(4 ℃、12 000×g、15 min),收集上清液,分別用2 mol/L HCl溶液或NaOH溶液調(diào)節(jié)上清液pH至5.5,離心(4 ℃、9 000×g、15 min),收集沉淀,再用0.5 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)沉淀pH至7.0,離心(4 ℃、12 000×g、15 min),收集沉淀便得到酸堿分離蛋白。

1.3.3 漂洗魚糜的制備

參照袁凱等[9]的方法略加修改。稱取一定量的碎魚肉,與4 ℃超純水按照料液比1∶4(g∶mL)混合,恒溫水浴槽中攪拌4 min,靜置8 min,雙層紗布過濾,漂洗2次,與分離蛋白在相同條件下脫水,取沉淀。

1.3.4 感官評價

參照WHITE等[10]的方法,4種樣品分別稱取40.0 g在隔水蒸制10 min后,選取8名感官員采用直線評估法對4種樣品的鮮、甜、苦、咸、酸進行5點強度打分。5點強度分別是沒感覺(0分)、弱(1分)、稍弱(2分)、中等(3分)、稍強(4分)、強(5分)。

1.3.5 電子舌檢測

4種樣品在隔水蒸制10 min后,分別稱取2 g加25 mL 超純水,均質(zhì)2 min后超聲5 min,靜置30 min,冷凍離心(4 ℃,10 000×g,15 min)取上清液,沉淀重復上述操作,合并2次上清液后過濾,并定容至250 mL,將濾液倒入電子舌專用進樣杯中在室溫條件下進行測定,每個樣品重復測定7次。

1.3.6 游離氨基酸測定

參考付娜等[11]的方法,稱取0.5 g(精確到0.000 1 g)樣品,用5%的三氯乙酸進行前處理后,用0.22 μm的水相濾膜過濾至進樣瓶中,在全自動氨基酸分析儀中測定游離氨基酸。

1.3.7 5′-核苷酸的測定

參考邱偉強等[12]的方法,略有修改。

HPLC參數(shù)：ODS-3/C18色譜柱(5 μm,4.6 mm×250 mm),柱溫30 ℃,流速1 mL/min,進樣量10 μL,紫外檢測器檢測波長245 nm。

流動相A為CH4O溶液,B為20 mmol/L磷酸二氫鉀與20 mmol/L磷酸氫二鉀溶液,并用磷酸調(diào)節(jié)pH至5.75。梯度洗脫程序如下：0.00～6.00 min(100% 流動相B)；6.01～15.00 min(2%流動相A，98% 流動相B)；15.01～20.00 min(8%流動相A，92% 流動相B)；20.01～22.00 min(35%流動相A，65% 流動相B)；22.01～24.00 min(30%流動相A，70% 流動相B)；24.01～30.00 min(100% 流動相B)。

1.3.8 水溶性無機離子的測定

鉀、鈉的測定按照GB 5009.91—2017;鈣的測定按照GB 5009.92—2016;鎂的測定按照GB 5009.241—2017；鋅的測定按照GB 5009.14—2017；鐵的測定按照GB 5009.90—2016,檢測4種樣品中的K+、Na+、Ca2+、Mg2+、Zn2+、Fe3+濃度。

1.3.9 味道強度值及味精當量(equivalent umami concentration,EUC)

滋味物質(zhì)的味道強度值(taste activity value,TAV)的計算如公式(3)所示：

(3)

式中：TAV,味道強度值；C,滋味物質(zhì)的絕對濃度；T,滋味物質(zhì)的閾值。

味精當量的計算如公式(4)所示：

(4)

式中：EUC,味精當量,g MSG/100 g；ai,鮮味氨基酸(Asp、Glu)的含量,g/100 g；bi,鮮味氨基酸相對于MSG的相對鮮度系數(shù)(Glu為1、Asp為0.077)；aj,呈味核普酸(IMP、AMP)的含量,g/100 g；bj,呈味核普酸相對于IMP的相對鮮度系數(shù)(IMP為1、AMP為0.18)；1 218,協(xié)同作用系數(shù)。

1.3.10 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)由 Excel、SPSS 20.0 進行分析,結(jié)果以平均值±標準偏差(mean±SD,n=3)表示；主成分分析由Alpha Soft 14.0 進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 藍點馬鮫魚蛋白的溶解和回收

藍點馬鮫魚蛋白的溶解度變化規(guī)律如圖1-a所示,pH在1.5～13.0,溶解度曲線呈U字形,這與鳙魚[13]、藍圓鲹[14]、鯉魚[5]等研究結(jié)果一致。在pH 2.0～3.0或12.0～13.0,藍點馬鮫魚肉蛋白溶解度較大,由于在極端酸堿條件下,蛋白質(zhì)分子帶同種電荷,與水分子結(jié)合,具有強烈的靜電排斥,溶解度相對較高；在pH 5.0～6.5,藍點馬鮫魚肉蛋白的溶解度較低,可能是由于蛋白質(zhì)等電點在pH 5.0～6.5,溶液中蛋白質(zhì)凈電荷為零,缺少靜電排斥,蛋白溶解度相對較低[15]。

a-魚肉在不同pH值下的蛋白溶解度；b-不同pH溶解后在等電點pH為5.5沉淀的蛋白回收率；c-在等電點pH 5.0、5.5、6.0沉淀的蛋白回收率

圖1 蛋白的溶解度和回收率

Fig.1 Protein solubility and recovery

因此選擇在溶解度較高的溶解pH(1.5、2.0、2.5、12.0、12.5、13.0),溶解度較低的沉淀pH(5.0、5.5、6.0)下,分別通過pH變換法收集藍點馬鮫魚分離蛋白,結(jié)果如圖1-b所示,極性酸堿環(huán)境除溶解pH為1.5外,其他溶解pH在沉淀pH為(5.0、5.5、6.0)下,回收率都較大,并且相同溶解pH的回收率在沉淀pH為5.5時均高于其他2個沉淀pH,但沒有顯著性差異(P>0.05),由此推斷藍點馬鮫魚肉蛋白的等電點在5.5附近；在極端酸性條件下,蛋白質(zhì)分子會完全解離,在堿性條件下變性程度小,可能會造成極端堿溶條件下蛋白的回收率會高于極端酸溶條件[16]；同時發(fā)現(xiàn)回收率與溶解度呈現(xiàn)正相關(guān),即溶解度越大,回收率越大。

因此選擇沉淀pH為5.5,在溶解pH為1.5～13.0下,測定最高回收率下的溶解pH,結(jié)果如圖1-c所示,在沉淀pH為5.5時,堿性溶解pH為12.5與溶解pH為13.0的蛋白回收率最高,但無顯著差異,因此選擇溶解pH為12.5,沉淀pH 5.5,制備堿分離蛋白；在沉淀pH為5.5時,酸溶解pH為2.5的蛋白回收率最高,因此選擇溶解pH為2.5,沉淀pH為5.5,制備酸分離蛋白。

2.2 感官評價

感官評價結(jié)果見圖2。結(jié)果表明,pH變換和漂洗法可使藍點馬鮫魚的鮮、甜、苦、咸味降低。堿分離蛋白與其他2組樣品相比,能夠較好地保留甜味和鮮味。咸味結(jié)果顯示,pH變換法與漂洗法相比,可有效降低樣品的咸味。總體看來,漂洗魚糜與分離蛋白的滋味都變差,但堿分離蛋白能夠保留原料肉部分甜味與鮮味。

圖2 四種樣品的滋味感官圖

Fig.2 Taste profiles of four kinds of samples

2.3 電子舌分析

主成分分析(principal component analysis,PCA)是通過正交變換將一組可能存在相關(guān)性的變量轉(zhuǎn)換為一組線性不相關(guān)的變量,按需選取幾個綜合指標,對研究對象進行簡化和綜合評價的一種多元統(tǒng)計分析方法。PCA圖顯示(圖3),Discrimination index=82,說明電子舌可完全分開4種樣品。PC1貢獻率為62.538%、PC2貢獻率為32.615%,主成分累計貢獻率達到95.15%。說明主成分PC1、PC2包含了大量原始數(shù)據(jù)中的信息,因而該圖能夠有效反映4種樣品的滋味輪廓差異。從圖3可以看出,4種樣品在PCA圖中分布呈現(xiàn)一定的規(guī)律,與原料肉的二維截距大小依次為漂洗魚糜>堿分離蛋白>酸分離蛋白,由此可得,經(jīng)過漂洗和pH變換法均可使原料肉的滋味發(fā)生改變,且不同方法對原料肉滋味的影響程度不同,與漂洗相比,pH變換法可能會較好地保存原料肉部分滋味特征,進而需要通過游離氨基酸、呈味核苷酸進行定量分析。

圖3 電子舌主成分分析圖

Fig.3 Principal component analysis plot for electronic tongue data of four samples

2.4 水溶性無機離子分析

無機離子在水產(chǎn)品中的滋味中起到呈味輔助劑和鮮味增強劑的作用,尤其是正離子(Na+、K+)屬于定位基并且易被味覺感受器吸附而呈現(xiàn)出咸味,對食品的滋味形成有關(guān)鍵的輔助作用[17-18]。原料肉中Na+、K+、Mg2+的TAV都大于1,說明這3種無機離子對藍點馬鮫魚肉的滋味貢獻較大。圖4顯示,經(jīng)過漂洗和pH變換法處理后,漂洗魚糜和酸堿分離蛋白中各無機離子都有不同程度的降低,K+降低程度最為顯著,其中只有酸分離蛋白中Na+超過閾值,可能由于在調(diào)節(jié)pH的過程中會引入NaCl,造成Na+殘留,說明這2種方法均可降低原料肉中的鹽度,這與感官評價結(jié)果一致。但微量元素Fe3+、Zn2+的降低程度遠小于K+和Mg2+,說明漂洗和pH變換法可在一定程度上保留部分微量元素,與總氨基酸一致,不會造成營養(yǎng)過多的損失[19]。無機離子含量的改變會造成滋味的差異,漂洗魚糜和酸堿分離蛋白可能會因為Na+、K+的缺失造成咸味、鮮味的降低。

圖4 四種樣品的水溶性無機離子含量

Fig.4 Comparison of inorganic ion contents in four samples

2.5 游離氨基酸分析

游離氨基酸是食品中主要呈味物質(zhì)之一,主要呈現(xiàn)鮮、甜、苦這3種味道,其種類和含量的不同會造成食品滋味的不同,且各游離氨基酸不僅有固有的呈味效果,還會與食品中其他物質(zhì)發(fā)生協(xié)同作用呈現(xiàn)出不同的滋味[20]。

由表1可知,4種樣品游離氨基酸總量由大到小依次為原料肉(319.01 mg/100 g)>堿分離蛋白(165.91 mg/100 g)>漂洗魚糜(160.27 mg/100 g)>酸分離蛋白(151.61 mg/100 g),可能由于漂洗和pH變換法都經(jīng)過水洗的過程,造成水溶性的呈味游離氨基酸溶解到溶液中,造成游離氨基酸減少。

表1 四種樣品中游離氨基酸含量及TAV 單位：mg/100 g

Table 1 Free amino acid content and TAV in four samples

注：-表示無相應數(shù)值;N.D.表示未檢出;同一行不同字母表示組間有顯著性差異(P<0.05)(下同)

由圖5可知,原料肉經(jīng)過漂洗或pH變換法處理,呈鮮、甜、甜/苦、苦味游離氨基酸總量都顯著降低(P<0.05)。但其中堿分離蛋白呈鮮、甜味游離氨基酸總量都顯著大于漂洗魚糜與酸分離蛋白(P<0.05),甜/苦味的游離氨基酸總量與漂洗魚糜和酸分離蛋白無顯著性差異,但其呈苦味游離氨基酸總量顯著小于漂洗魚糜與酸分離蛋白(P<0.05),因此,堿分離蛋白的滋味會優(yōu)于漂洗魚糜與酸分離蛋白。

圖5 四種樣品中游離氨基酸含量

Fig.5 Free amino acid content in four samples

原料肉中Glu的TAV>1,對原料肉的滋味貢獻較大,而漂洗魚糜、酸分離蛋白、堿分離蛋白分別降低了91.83%、90.02%、66.62%,由此可知,這2種方法都降低了原料的鮮味,與漂洗魚糜和酸分離蛋白相比,堿分離蛋白的鮮味較強,這與感官評價結(jié)果一致；Gly和Ala為水產(chǎn)品中主要的呈甜味氨基酸,原料肉中Gly含量較少,且Gly閾值較高,因此Ala為藍點馬鮫魚呈甜味的主要物質(zhì),經(jīng)過漂洗和pH變換法處理后,漂洗魚糜、酸分離蛋白、堿分離蛋白中Ala分別降低了46.69%，68.75%，52.85%，降低程度遠小于Glu，由此可得,漂洗和pH變換法可有限的保留原料肉的甜味；呈甜/苦味氨基酸,在經(jīng)過漂洗和pH變換法處理后,均有不同程度的降低,且原料肉中呈苦味氨基酸Tyr在其他3種樣品中并未檢測出,可能因為低于檢測限,但是Phe在酸分離蛋白和漂洗魚糜中含量增高,可能是由于蛋白質(zhì)變性使得Phe堆積,從而會造成苦味增加[21-22]。呈苦味氨基酸His閾值較低,為樣品中主要呈苦味物質(zhì),含量分析顯示,漂洗魚糜和酸堿分離蛋白中該物質(zhì)均顯著降低(P<0.05)。綜上,漂洗魚糜和酸堿分離蛋白,鮮味、甜味、苦味都有所降低,但堿分離蛋白與漂洗魚糜和酸分離蛋白相比,能夠較好地保留一部分鮮、甜味,較大程度地降低苦味。

2.6 核苷酸分析

核苷酸及其降解產(chǎn)物在水產(chǎn)品中是對滋味貢獻較大的呈鮮味物質(zhì)之一,并且與呈味氨基酸有協(xié)同作用,主要包括4種核苷酸(5′-AMP、5′-GMP、5′-IMP、5′-XMP)[23],有較多研究表明5′-GMP在魚類中含量較少[24],5′-XMP由5′-IMP在魚體死后發(fā)生氧化反應產(chǎn)生,本實驗在低溫條件下取肉后立即處理,并未產(chǎn)生大量5′-XMP,因此對5′-GMP、5′-XMP不做研究,BREMNER等[25]研究表明次黃嘌呤(hypoxanthine,HX)會呈現(xiàn)苦味,造成滋味變差,因此通過5′-AMP、5′-IMP、HX含量的變化,研究原料肉、漂洗魚糜和分離蛋白的滋味差異。

表2顯示,在經(jīng)過漂洗和pH變換法處理原料肉后,5′-AMP、5′-IMP、HX都有不同程度的降低,由此可得,與原料肉相比,漂洗魚糜和酸堿分離蛋白的鮮味有不同程度的降低,只在堿分離蛋白中保留較多的5′-AMP和HX,施文正等[26]研究表明,當IMP與AMP低含量共存時,依舊可以呈現(xiàn)出鮮味,并且甜味增加,因此堿分離蛋白能夠呈現(xiàn)出一定量的鮮味和甜味。YAMAGUCHI等[27]提出5′-核苷酸會與呈鮮味游離氨基酸(Glu、Asp)產(chǎn)生協(xié)同作用,即使含量非常低的5′-IMP也可極大的提高氨基酸的呈鮮味效果,并且會增加甜味效果,因此利用EUC值對該協(xié)同效應進行評價,如表2所示,堿分離蛋白的EUC值是漂洗魚糜和酸分離蛋白的5倍左右,綜上,漂洗魚糜和酸堿分離蛋白,鮮味都有所降低,與游離氨基酸結(jié)果顯示一致,但堿分離蛋白能夠較好地保留一部分鮮味。

表2 呈味核苷酸含量及EUC值

Table 2 Taste nucleotide content and EUC value

3 結(jié)論

根據(jù)實驗結(jié)果,可以得到以下結(jié)論：電子舌能夠有效區(qū)分4種樣品,漂洗和pH變換法都可造成藍點馬鮫魚肉滋味輪廓發(fā)生改變,但酸分離蛋白與堿分離蛋白較為相似；漂洗魚糜與pH變換法均可降低鹽度,而且還可以在一定程度上保留一部分微量元素,但會因Na+、K+的缺失造成咸味、鮮味的降低；漂洗和pH變換法都會造成藍點馬鮫魚呈味氨基酸、呈味核苷酸不同程度的流失,造成滋味變差,但與漂洗魚糜和酸分離蛋白相比,堿分離蛋白能夠較大程度地保留部分呈味物質(zhì)。綜合可知,漂洗和pH變換法都造成呈味物質(zhì)的損失,同時也降低了原料肉中的鹽度,其中堿分離蛋白能夠在降低鹽度的同時較多地保留部分呈味物質(zhì),可利用堿分離蛋白的方法制備低鹽的蛋白配料,并為分離蛋白滋味改良提供理論基礎(chǔ)。